受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的策略

高效表达外源蛋白,在生物制药中有重要意义.中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell）是表达外源蛋白的最佳真核表达系统之一.影响外源蛋白在CHO细胞表达的因素甚多,主要包括载体、宿主细胞和外源基因几方面.深入了解和灵活运用它们之间的关系,有助于获得外源基因在CHO细胞中的高效表达.     

融合表达载体的研究进展

基因工程的实施,主要包括DNA克隆、外源基因的表达及其重组产物的纯化。基因表达是指一个外源基因在表达系统中,既能高效表达又具有原来的生物学活性。目前有三个表达系统,即大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中大肠杆菌最早研究应用,但表达质粒转人受体菌（宿主）后,并不都能获得理想的结果,它涉及到许多因素：诸如基因结构的特点、mRNA的转录效率、蛋白质的折叠、宿生蛋白酶对重组产物的水解作用、外源基因和E·COlt基因间所存在的差异以及表达产物对宿主细胞的毒性等;此外,在高效表达的同时,为了更好地获得人们所需要的重…     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO—OT。将2个外源基因克隆至pTO—OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达量为25％～30％。Western印迹分析证实了重组蛋白在大肠杆菌中表达后可被信号肽酶有效识别,切割后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性,显示了该原核表达载体在基因工程中的应用价值。     

重组微生物生理学

重组微生物生理学主要研究外源基因与宿主的相互作用以及细胞生理状态对这种相互作用的影响。宿主与外源基因的相互作用可发生在复制、分配、表达、代谢等各种水平,主要的分子机制为核酸-核酸、核酸-蛋白质的相互作用,一些小分子化合物可作为信号或效应子参与大分子的相互作用。重组微生物生理学研究主要包括下列三方面工作:1.噬菌体、质粒与宿主的相互作用以及基因工程菌中目的基因的复制、分配和表达规律。2.微生物响答系统的响答及适应的分子机制及其对外源基因调控的影响。3.细胞生长速率对宿主基因和外源基因调控的影响。这些工作融合了分子水平和细胞水平的研究,模糊了分子生物学和生理学的界限,成为基因工程的理论基础之一。美国微生物学会自1987年起把重组微生物生理学列为年会的一个独立专题。 外源基因与宿主的相互作用 噬菌体和质粒等染色体外基因与宿主基因处于一种依赖、互补和竞争的复杂关系。     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

基因诱变、重组、克隆

920861克隆的外源基因在大肠杆菌中增加表达的可能性〔英〕/Venetianer,p.了Aeta Bioteehnol一1991,11(2)一129~133〔译自DBA,1991,10 (15),91一08439习 在异源宿主(如大肠杆菌)中合成并累积想要的(外源)蛋白产物是一个复杂的多步骤过程,并受到以下步骤的影响:i。提高基因拷贝数的方法,如采用高拷贝数载体;11.提高和控制转录率的方法,如使用强启动子;111。提高翻译率的方法,如选用适宜的Shine一Dalgaroo序列;iv.增加合成蛋白或肤稳定性的方法,如表达融合蛋白;v.提高重组质粒稳定性的方法;如使用无需抗生素而能选择连续出现的质粒的方法;…     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。     

通过同源重组构建酿酒酵母新型表达质粒

利用同源重组的方法, 构建了具有高拷贝数和高稳定性的新型酿酒酵母表达质粒. 对酵母附加体型载体pHC11进行一系列改造, 得到质粒pHC11R, 并用适当的酶切线性化; 利用PCR反应得到人IFNα2b表达单元片段, 它的两端和线性化的pHC11R的两端具有50 bp左右的同源区段. 上述两个片段共转化酿酒酵母, 在酵母体内经同源重组后得到表达质粒pHC11R-IFNα2b, 该表达质粒与 pHC11-IFNα2b相比去除了质粒上用于在大肠杆菌中复制和筛选所需的序列, 在宿主菌中的稳定性和拷贝数均有明显提高, 同时外源基因的表达量也获得了一定程度的提高. 在此基础上, 进一步构建了带有不同表达元件的pHR系列载体, 使得外源基因能够通过同源重组在酿酒酵母中快速、方便地克隆和表达.     

重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

短芽孢杆菌a-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用PCR方法扩增短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pALDl。pALDl中的ALDC基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶80单位以下,比原始菌株提高200余倍。SDS-PAGE蛋白质分析表明,大肠杆菌DH5α(pALDl)表达的ALDC占细胞总蛋白量的40％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌DH5α(PALDl)和HB101(pALDl)分别在无选择压力下30℃连续培养50代以上,41℃诱导不同时间,DH5α(pALDl)在热诱导5h后,未发现质粒不稳定性,HB101(pALDl)在热诱导3h后,质粒基本稳定,但热诱导5h后,丢失质粒的细胞约占70％。     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。