高产吩嗪-1-羧酸（PCA）假单胞菌株M18G发酵优化模型的构建

吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid, PCA）是促进根际生长假单胞菌分泌的重要抗菌物质。采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面法（response surface method, RSM）对假单胞菌株M18（Pseudomonas sp. M18）的gacA基因突变株M18G的次级代谢产物PCA发酵的营养条件进行建模。运用Plackett-Burman（PB）设计试验,从12个营养成分中筛选出4个关键的组分,进而采用RSM 法对这4个因素进行中心组合设计试验,建立回归方程并进行统计学分析,绘制各营养因子之间的关系图。实验结果表明：建立的模型能合理地模拟并优化发酵中各参数及其浓度,确定发酵培养基的成分和浓度为：黄豆粉33.4g/L,葡萄糖12.7g/L,大豆蛋白胨10.9g/L和乙醇13.8 g/L, M18G菌株经60 h发酵培养,最高PCA产率能达到1.89 g/L,比优化前提高了6倍左右。各营养因子的等值线图表明黄豆粉和乙醇在PCA高产发酵中起到更为关键的作用,因此提供了提高PCA发酵产量的有效方法,并为其未来商业化应用奠定了基础。     

假单胞菌M18调控因子GacA与RsmA的相关性及对抗生物质合成代谢调控机制的分析

假单胞菌M18是一株可同时合成并分泌吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)和藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,Plt)两种抗生物质的生防菌株。为了进一步研究假单胞菌M18抗生物质合成代谢的调控方式与机制,在分别构建gacAr、smA等单基因突变株基础上,又构建了gacArsmA双基因突变株M18GR以及gacA′-l′acZ和rsmA′-′lacZ等翻译融合表达载体(pMEGA和pMERA)。通过在PPM和KMB两种培养基中发酵培养和两种抗生物质PCA和Plt的HPLC定量测定显示,双突变株M18GR的PCA和Plt的合成量不论在PPM还是在KMB培养基中都介于单突变株M18G和M18R之间。由实验结果分析推测,两种调控因子对抗生物质合成的调控作用不是发生在转录水平,很可能发生在转录后水平。由β-半乳糖苷酶的定量分析表明,在假单胞菌M18中,两种调控因子不存在自诱导机制;虽然GacA未调控RsmA的合成,但RsmA可能部分正向调控GacA的表达。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的15kb片段,中间插入编码Kmr的DNA片段,获得rsmA-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R-。突变株M18R-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20%。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

聚半乳糖醛酸酶高产菌的产酶条件研究

通过单因素及正交试验对米曲霉（Aspergillus orza）C491产生聚半乳糖醛酸酶的发酵条件进行了优化。该菌株的摇床发酵滤液以桔子果胶为底物时酶活力可达344．8U／mL。产酶最适培养基组成为：麦芽汁（糖度6％）中添加6％桔皮粉,2％硫酸铵（w/v）。最适培养条件：起始pH4（灭菌前）,30℃,r/min,培养112h。Tween80可以促进C－491产酶。     

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍(NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M18存活率的影响,NTG的诱变剂量25～200mg／L,处理时间10～30min范围内,随着诱变剂剂量增加和时间的延长,M18的存活率不断下降。NTG的作用剂量25mg／L,处理时间10min时,细菌存活率为55％左右。利用细菌存活率为55％时的诱变条件,经生物测定,初筛获得20株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛,从这20株诱变株中,获得PCA高产诱变株M18N07。并对此菌株发酵条件进行调整,较理想的培养条件为：蛋白胨18g／L,葡萄糖16g／L,氯化钠1g／L,硝酸钾10g／L。小瓶培养时间17h,大瓶5％接种量,28℃培养54h。     

番茄感染TMV诱导的β-1,3-葡聚糖酶的纯化和性质

番茄系统感染TMV诱导对胞外β—1,3—葡聚糖酶活性升高。番茄叶胞外提取液经冰冻干燥浓缩、-20℃丙酮沉淀、CM-Sephadex C-25离子交换层析和PBE 94聚焦层析纯化,获得PAGE和SDS-PAGE均一的β—1,3—葡聚糖酶。测得该酶的分子量为22kD;以昆布多糖为底物,该酶的最适pH5.4,最适温度30～40℃;K_m和V_(max)值分别为5.64mg/ml和 0.328nmol/s。在感染TMV的番茄叶中,β—1,3—葡聚糖酶活力大部分位于胞外,它是番茄叶胞外提取液中主要的病原相关蛋白。     

假单胞菌M18中藤黄绿菌素合成限速酶基因的鉴定及表达优化

【目的】假单胞菌株M18中负责抗真菌剂藤黄绿菌素(Plt)合成的结构基因包括pltLABCDEFG、pltM。为了鉴定Plt合成限速酶的基因,分别将9个结构基因过表达。【方法】以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增这9个Plt合成基因的编码区,分别克隆到穿梭载体pME6032的tac启动子下游,构建9个结构基因的过表达载体,并转入假单胞菌株M18中。在KMB培养基中进行Plt发酵分析。【结果】分别携带pltC、pltD、pltF过表达载体的菌株与携带空质粒的菌株相比,Plt产量分别提高了96%、78%、75%。对重组菌株进行IPTG诱导浓度和诱导时间的优化,确定IPTG最佳诱导浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导时间为培养6 h。【结论】pltC、pltD、pltF分别编码的Ⅰ型聚酮合成酶、卤化酶、乙酰CoA合成酶可能为Plt生物合成的限速酶。按照优化条件发酵,携带pltD、pltF过表达质粒的菌株产量分别上升77.5%、159.1%。     

假单胞菌M18调控基因ppbR的克隆及功能研究

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素.根据生物信息学分析,铜绿假单胞菌PA2572基因编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子.本研究从假单胞菌M18基因组中扩增出PA2572同源基因片段ppbR,利用体外定点插入突变和同源重组技术构建了M18的ppbR突变株M18P.研究结果表明,突变株M18P在泳动能力和群集运动能力上有显著的下降.突变株合成PCA的能力比野生型有显著的下降,在发酵液中PCA积累量仅为野生型的50%.在KMB培养基中,突变株Plt的积累量和野生型没有显著的差异.     

假单胞菌株M18 gacA基因的克隆、表达及蛋白纯化

GacA是GacS/A双元调控系统的一个组分, 克隆假单胞菌株M18中的gacA基因。测序结果同Pseudomonas sp. PAO1比较, 该基因2个碱基的改变未引起氨基酸的改变。将该基因克隆到表达质粒pET28b (+)中, 将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中, IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化, 蛋白纯度约为98%, 质谱鉴定证明纯化的蛋白为GacA蛋白。CD谱分析GacA包含了4% α-helix, 48% β-sheet 和48%无规则卷曲。GacA蛋白的获得为进一步研究其晶体结构、生物学性能以及GacS/A双元调控系统奠定了基础。     

假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控

假单胞菌株M18分泌藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,Plt )和吩嗪1羧酸（Phenazine1carboxylic acid, PCA）并抑制多种植物病菌的生长。 从M18中克隆双基因调控系统gacS/gacA的组成基因gacA,并构建了该基因抗性插入突变株M18G。在KMB培养基中,M18G合成Plt的能力受到完全抑制,而PCA的积累约比野生型提高31倍左右。Plt合成基因簇突变株M18T和在M18G基础上构建的PCA合成基因簇突变株M18GA的Plt和PCA合成的动力学变化表明,在M18G菌株中,Plt合成的抑制并不引起PCA的过量积累,PCA的过量积累也不引起Plt合成的抑制。由此推测,gacA在基因表达的水平上全局性地执行着调控功能。