NFY结合位点缺失下调NPCEDRG基因启动子转录活性和效率

NPCEDRG基因是一个鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)相关基因. NPCEDRG基因启动子为TATA-less启动子,其核心启动子区域位于-146 ～-8 bp区,该区域包含NFY、STAT1和cMYB等转录因子结合位点. 前期研究结果提示,转录因子NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控. 为明确NFY转录因子在NPCEDRG基因转录中的作用,本研究应用报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因核心启动子区进行NFY结合位点（或CCAAT-box）缺失突变及其功能分析,分别构建NPCEDRG基因核心启动子区NFY结合位点缺失突变的Luc和EGFP报告基因表达载体. 比较核心启动子和NFY结合位点缺失突变体报告基因载体的转录活性和效率. 结果表明,在MCF7和CNE2细胞中,NFY结合位点缺失突变体的转录活性分别约为其核心启动子转录活性66.94%和75.72%,即NFY结合位点缺失致使该启动子转录效率在MCF7和CNE2细胞中分别降低了33.06%和24.28%;EGFP报告基因表达载体系统研究结果与Luc报告基因载体系统结果基本吻合. 本研究再次证实,转录因子NFY通过结合NPCEDRG基因启动子的核心元件NFY结合位点参与NPCEDRG基因的转录调控,并提高其基因转录活性和效率.     

人Boule基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的：对精子发生RNA结合蛋白Boule基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法：从基因参考序列数据库获取Boule基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果：成功获得长度为2kb的人Boule基因启动子区序列。该启动子区Thresholdscore〉90的共有60个转录因子结合位点,涉及sox家族、GATA结合蛋白家族、热休克因子家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、同源异型框基因家族、TALE类同源结构蛋白家族、转录因子螺旋环螺旋家族、IKAROS家族、FOX家族11个家族的转录因子和3个TATAbox。结论：Boule基因表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Boule基因表达的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

人Sirt6基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人Sirt6基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从Gene Bank数据库中获取人Sirt6基因5’调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在939、276、70和9个可能的转录因子结合位点,包含Ahr、SPIB、Pdx1、Prrx2、MZF1、Mafb和KLF5等。结论:人Sirt6基因5’调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与免疫系统调节、肿瘤发生和代谢调节等有关。     

人Daintain 基因5'调控区序列的生物信息学分析

目的：探讨人Daintain 基因5''调控区的序列特征。方法：利用在线软件BLAST、Neural Network Promoter Prediction、Promoter 2.0、Promoter SCAN、EMBOSS、CpG Island Searcher 和TF SEARCH预测人Daintain 基因启动子区域、CpG 岛分布和转录因子结 合位点。结果：人Daintain 基因5''调控区存在1 个CAAT盒。Daintain 基因可能存在6 个启动子位点,CpG岛可能位于216 bp 区 间( 23 ~ 238 bp)。评分85 分以上时,该序列存在251 个可能的转录因子结合位点;评分90 分以上时,该序列存在70 个可能的转 录因子结合位点;评分95 分以上时,该序列存在16个可能的转录因子结合位点;评分100 分以上时,该序列存在7 个可能的转 录因子结合位点;这些结合的转录因子基本是与免疫细胞增殖或性别发生有关。结论：人Daintain 基因5''调控区的生物信息学研 究表明其转录受甲基化和多种转录因子的调控,为研究Daintain 基因启动子的功能提供理论基础。     

转录因子结合位点的计算分析方法

基因组上众多基因和非编码转录体按照特定的规律有序地表达是细胞正常生命活动的基础。转录调控是基因表达调控的关键步骤,转录因子结合在基因启动子序列中的转录因子结合位点,启动基因的转录和控制基因的转录效率。分析转录因子结合位点对研究基因调控系统有着重要意义,生物信息学在转录因子结合位点的研究中发挥着关键的作用。文章综述了分析蛋白质编码基因的转录因子结合位点的典型流程,总结了主要的算法、软件和资源,并简要评述了目前非编码RNA转录调控的研究现状。     

不同牛种STAT5B基因启动子多态性分析

目的:试验旨在筛选STAT5B基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响,为地方牛种选种选育提供一定理论依据.方法:选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点.结果:STAT5B基因5'调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为:T-181C、C-31G、T+119C.生物信息学软件预测得到STAT5B基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致5个转录因子结合位点消失,而产生8个新的转录因子结合位点.软件未发现可能的CpG岛范围,但STAT5B基因RNA二级结构和最小自由能在突变后显著改变.结论:DNA池结合测序技术可快速筛选SNP位点,STAT5B启动子区存在功能性SNP位点.     

空间飞行水稻pi-hit-1基因启动子功能分析

pi-hit-1基因是本实验室通过空间诱变找到的一个水稻新基因。为了对pi-hit-1基因启动子结构和功能进行研究,首先使用植物启动子分析数据库(PlantProm DB-TSSP,TFSEARCH,PLACE及PlantCARE)对该基因转录调控区序列进行预测分析,结果显示该基因上游调控区存在多个顺式元件,主要集中在翻译起始位点前300bp的区域,转录起始位点位于翻译起始位点前100bp,在转录起始位点前132bp存在TATA box元件。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)发现翻译起始位点上游约300bp存在转录因子特异结合位点,为该基因的核心启动子,这与预测结果一致。采用系统生物学的方法研究水稻新基因pi-hit-1启动子结构,发现了该基因的核心启动子元件,为研究空间环境如何影响基因的转录调控提供了重要依据。     

抑癌基因p53蛋白产物与DNA相互作用的研究进展

抑癌基因p53蛋白产物是一种多功能的转录调控因子,其C-末端含DNA结合区,N-末端含转录激活区。它能通过磷酸化或构象变化来激活其DNA结合活性,从而与某些基因的启动子区结合而激活它们的转录,而对不具有与其结合位点基因的转录起抑制作用。p53蛋白还能作为一种DNA复制因子,通过与某些基因的复制起始区结合而对它们的复制或修复进行调控。对基因转录或复制的调控都最终反映在对细胞周期的调控上。     

人Toll样受体9基因启动子区的生物信息学分析

目的:探讨人Toll样受体9(TLR9)基因启动子区序列特征。方法:利用生物信息学技术预测人TLR9基因启动子区域、转录因子结合位点和CpG岛分布。结果:人TLR9基因启动子区有1434个转录因子结合位点,人和小鼠保守区域内存在23个共同的转录因子结合位点,人TLR9基因启动子区包含长572 bp的CpG岛。结论:人TLR9基因启动子区相关生物信息学的研究,提高了针对启动子的研究效率,并为预测基因启动子的功能提供了重要信息。     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

人TCF7L2基因启动子生物信息学分析

[目的]探讨人TCF7L2基因启动子特征。[方法]从UCSC数据库获得人TCF7L2基因5'调控区2 000 bp序列,利用多种在线软件对启动子、转录因子结合位点、Cp G岛、SNP等进行分析。[结果]5'调控区2 000 bp序列正义链上至少存在5个潜在的启动子,其中-242～-192 bp、-853～-803 bp之间可能包含核心启动子。查找到1个TATA盒,存在1个长度为499 bp的Cp G岛。Ali Baba2. 1、PROMO和JASPAR软件分别预测到241、944、1 035(正义链)个转录因子结合位点。利用conreal程序在人和小鼠TCF7L2基因启动子保守区域内预测到207个共同的转录因子结合位点,涉及到66种转录因子。启动子区发现2个SNP位点。[结论]对人TCF7L2基因启动子进行了生物信息学分析,获得了启动子特征。     

Ikaros调控FUT4转录活性及其机制的初步分析

岩藻糖基转移酶IV(fucosyltransferase IV,FUT4)是催化蛋白质岩藻糖基化的关键酶,参与肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润,但关于FUT4的转录调控机制目前尚不清楚。该文通过对人FUT4基因近端启动子序列进行分析,构建不同长度启动子删减体的荧光素酶报告基因表达载体,分析其转录活性。转录因子结合位点在线网站ALGGEN预测FUT4近端启动子序列,发现转录因子Ikaros在FUT4的启动子区有潜在的结合位点。该研究旨在初步探讨Ikaros调控FUT4转录活性,进一步完善FUT4的调控机制。荧光素酶活性分析FUT4基因启动子删减体的转录活性和Ikaros对FUT4转录活性的影响。结果显示,FUT4转录起始位点上游1.2 Kb(FUT4-1.2 Kb)在293T细胞中转录活性最高;Ikaros抑制FUT4的转录活性,且呈现剂量依赖效应;当Ikaros的DNA结合位点发生缺失性突变时,能够解除Ikaros对FUT4转录活性的抑制作用。     

贵州本地山羊TFB1M基因启动子区多态性生物信息学分析

目的:采用DNA池结合PCR技术,筛选TFB1M基因启动子区SNP位点,并分析其对启动子区的影响。方法:利用多种生物信息学软件预测TFB1M基因核心启动子范围、转录因子结合位点、CpG岛。结果:TFB1M基因启动子区发现1个SNP位点G-234A。TFSEARCH软件预测结果显示TFB1M基因启动子区转录因子ADR1与Sp1位置调换,且ADR1位置的提前导致TFB1M基因转录效率增高。结论:G-234A位点可能影响TFB1M基因转录,试验结果为进一步分析TFB1M基因启动子区功能奠定基础。     

人G6PD基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人G6PD基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从Gene Bank数据库中获取人G6PD基因5’调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:获得人G6PD基因5’调控区序列2200 bp(-2000~+200 bp)。Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在805、258、66和17个可能的转录因子结合位点,包含Maf G、Pdx1、Prrx2、MZF1、SPIB、KLF5和SP1等因子。结论:人G6PD基因5’调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与胰腺发育、肿瘤发生和氧化应激有关。     

老年痴呆症相关基因Nicastrin的转录调控

APP蛋白经过降解,形成老年痴呆症患者脑内老年斑的主要成分.由PS(早老素),NCT,PEN-2和APH-14种膜蛋白组成的γ分泌酶催化该降解过程.为了了解人类nicastrin(NCT)基因的转录调控机制,确定了其在人脑中的转录起始位点以及其编码区上游大小不等片段的转录起始活性.EMSA分析证实NCT启动子区的4个AP-1结合位点和2个NFAT结合位点能够与相应的转录因子结合,能够改变转录因子调控能力的定点突变和PDTC诱导使得NCT启动子在HeLa细胞和人鼠皮质神经元中的启动活性都有所改变.以上结果说明:AP-1和NFAT确实参与了人类NCT基因的转录调控.     

猪早期胚胎发育中SOX2基因启动子活性分析

转录因子SOX2 (sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254～2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。     

人NPCEDRG基因启动子的克隆及CCAAT/NFY结合位点初步分析

NPCEDRG基因是采用基因定位候选克隆策略获得的一个鼻咽癌候选抑瘤基因.NPCEDRG在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,重新恢复NPCEDRG基因在CNE2细胞系的表达,可部分逆转CNE2的恶性表型.为揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,联合应用生物信息学和报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因启动子区进行克隆及功能分析,系统发育进化足迹分析结果表明,NPCEDRG基因5′端调控区-180～+235 bp区间在脊椎动物中高度保守,该保守区域中存在包括CCAAT/NFY、STAT1和SP1等转录因子结合位点.构建Luc和/或EGFP报告基因表达载体并检测其启动子活性,-146～-8 bp区域有较强的启动子活性,电泳迁移阻滞分析实验(EMSA)提示,CCAAT/NFY转录因子结合位点是NPCEDRG基因的转录调控元件.因此,研究确定-146～-8 bp区域是NPCEDRG基因核心启动子区域且启动子核心元件CCAAT/NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控.     

副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

为了探讨副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS) VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录,该抑制机制与CalR无关联。