睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔

目的研究磷酸酪氨酸互作结构域1(PID1)基因与肌内脂肪含量的关系,探究睾丸注射法在转基因动物制备中的可行性。方法将携带猪PID1基因的重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与转染试剂共孵育后,对新西兰兔进行了睾丸打点注射试验。对繁殖的F1代个体进行了活体荧光检测、PCR和western blotting检测,以及抽样屠宰进行肌内脂肪含量等检测;将F1代阳性个体互交,繁殖了F2代兔,对其进行了阳性率检测以及肌内脂肪含量检测。结果外源PID1基因和荧光蛋白基因在后代中均成功表达,其中,F1代阳性率为35.88%,F2代阳性率为34.33%;转基因阳性兔与阴性和空白对照兔相比,PID1蛋白表达水平有所增加,肌内脂肪含量有显著提高(P0.05)。结论 PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关,同时,进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物,且外源基因可以稳定遗传。     

茶树胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1s的克隆及表达分析

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是植物氮素同化过程中的限速酶。本试验选取茶树(Camellia sinensis)‘龙井43’为材料,利用RACE法克隆得到3个茶树CsGS1s基因成员。序列分析显示CsGS1.1、CsGS1.2和CsGS1.3基因全长分别为1 634、1 482和1 398 bp,其开放阅读框长度均为1 071 bp,编码356个氨基酸;CsGS1s蛋白均为亲水性、非分泌蛋白,定位在细胞质中且无跨膜结构。序列比对显示CsGS1.1s具有GS1基因家族的特征区域。系统进化树分析表明,CsGS1.1s与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)、大麦(Hordeum vulgare)、水稻(Oryza sativa)以及玉米(Zea mays)的GS1表现出较近的亲缘关系。CsGS1s组织特异性表明,CsGS1.1和CsGS1.3在根部表达量最高,CsGS1.2主要在叶中表达,但总体来看CsGS1.2在上述器官的表达丰度极低。利用实时荧光定量PCR对茶树在不同氮源处理下的表达进行检测,结果表明,在茶树叶中,CsGS1.1的表达量主要在NO_3~-处理后期才显著提高,而CsGS1.2和CsGS1.3的表达量则主要受NH_4~+处理的影响;在茶树根中,CsGS1s的表达水平受铵态氮的诱导显著高于硝态氮,尤其是CsGS1.1和CsGS1.2。     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。