矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析

矮牵牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族的成员。该亚家族基因可能具有调控开花时间、抑制花器官衰老脱落和促进体胚形成等功能。本文应用YADE和hiTAIL-PCR等方法,克隆了PMADS9基因5′端翻译起始位点上游1853bp的启动子区域序列(FJ798977);RACE分析发现该基因至少有4个转录起始位点,2个位于编码区第一外显子内。启动子调控元件分析显示,PMADS9启动子富集花粉和种子发育过程中特异表达元件和与环境应答相关的元件;AGL15同源基因启动子存在非常保守的RY-repeat元件,启动子的保守性与物种的遗传距离不一致;推测PMADS9启动子翻译起始位点上游200～400bp和800～1000bp区域具重要功能。     

梅PGIP基因的启动子克隆及生物信息学分析

根据梅PGIP基因(GenBank登录号:DQ364056.1)5′端序列设计特异反向引物,利用染色体步行法获得了该基因上游1 037 bp的启动子序列.启动子结构分析表明,梅PGIP基因启动子序列与中国李PGIP基因启动子显著相似,相似度达89%~96%,较中国李PGIP基因启动子多一个100 bp的区段,与水稻和豆的启动子序列均无Blast比对结果.转录调控元件预测结果表明,克隆序列与豆相应序列的保守区存在着能调控抗病基因转录的GT1结合位点.     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

猪精浆蛋白基因PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ启动子序列克隆及生物信息学分析

分别用PCR方法扩增了1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子,并进行TA克隆,测序鉴定,测序结果用DNAstar程序与Genebank中的相应序列进行对比分析,结果显示与已发表序列的同源性分别为99.8%和96.3%。利用生物信息学的方法对克隆的1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子区进行了预测分析。PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因序列对比(mVista)分析发现,启动子0→-1000bp的保守性较高,其中0→-200bp核心启动子部分的序列同源性达到了100%,而-1000bp上游序列的保守性则较低。启动子的位置预测(Promoter Scan)结果显示,转录起始点上游200bp的区域为两基因的核心启动子位置。启动子区转录因子结合位点预测(TFSEARCH)发现,转录起始位点上游的1000bp区域内含有大量的顺式调控元件,并且得到了一系列潜在的转录因子结合位点。     

人及小鼠钠通道SCN3A基因的启动子及其上游调控区的分析

为了比较研究人与小鼠SCN3A基因的启动子及其上游调控区的特征,采用5′-Full RAGE方法对人及小鼠SCN3A基因的转录起始点进行了准确定位,通过序列测定及对比分析证明:确定人和小鼠SCN3A基因的转录起始点均为"A",人SCN3A基因转录起始点位于翻译起始点上游约27 kb处,而小鼠位于翻译起始点上游约31 kb处.人SCN3A基因5′非翻译区存在两个5′非翻译外显子,而小鼠只有一个5′非翻译外显子.人和小鼠SCN3A基因核心启动子区(-80～+70)的同源率高达96.0%,存在相同的启动子核心元件,BRE/和TATA;在-400至+200区段内预测到人存在而小鼠不存在的转录因子有PHR1、GATA-1、FOXN2、NF-及AP-4,小鼠存在而人不存在的转录因子Sp、Sp3及GBF.人和小鼠SCN3A启动子区特征的异同将为进一步研究该基因在人和小鼠的表达调控机制提供重要线索.     

水稻OsWRKY89启动子紫外线-B反应元件区的鉴定

植物需要利用太阳光能进行光合作用,因而不可避免地受到紫外线-B(UV-B) 辐射的影响．为了鉴定水稻WRKY转 录因子OsWRKY89基因启动子中的UV-B反应相关元件,分析了转启动子不同缺失片段与gus融合基因的水稻幼苗,发现在该启动子中存在UV-B反应元件,位于基因翻译起始位点上游-1 213～-1 188之间的25 bp区域,碱基序列为AAGATCTACCATTGCTCTATAGCTT．结合OsWRKY89和UV-B诱导上调表达基因启动子序列分析发现,该元件区在水稻UV-B反应基因启动子上具有高度的保守性,而且与已知保守的光反应元件位置邻近,表明该区域在水稻UV-B反应的转录调控中可能具有重要功能．     

人端粒酶催化亚基hTERT基因启动子的克隆

为了确定人端粒酶催化亚基 h TERT基因的启动子结构特征 ,采用 Panhandle PCR技术 ,从正常人外周血单核细胞基因组 DNA中扩增 h TERT基因 5′端上游旁侧序列 ,结果获得了 h TERT基因翻译起始位点上游 2 0 90 bp的基因组 DNA序列。序列分析表明 h TERT基因的启动子区域缺少典型真核启动子的核心元件 ( TATA box和 CAAT box) ,但含有多个已知转录因子蛋白结合的核心序列 ,如 E box及 Sp1核心序列。提示 h TERT基因的表达可能受特殊的转录因子调控 ,这些转录因子的激活可能与癌变细胞中 h TERT重新组成型表达有关     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

猪POU1F1基因5’侧翼区克隆及序列分析

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,对哺乳动物的早期发育和相关基因启动表达起重要的调控作用。本文利用染色体步移技术,从长白猪基因组中首次克隆到了约1．5kb的POU1F1基因5’侧翼区序列,并利用相关软件对其进行了序列分析和物种间POU1F1基因5’侧翼区序列比对及进化树构建。结果表明所克隆的片段中含典型的TATA盒（-57）和类CAAT盒序列（-87）。TESS软件分析发现在启动子附近有一系列潜在的重要的转录因子结合位点。序列比对结果表明不同物种POU1F1基因的转录起始点上游-150bp区域保守性较强,可能是启动子的核心序列。其中猪与牛的同源性最高,其次是黑猩猩、人、狗,与大鼠、小鼠和鸡同源性较低,与斑马鱼序列同源性最低。同源序列主要集中在转录起始点上游-150bp至-1000bp区域。Vista中的MLAGAN程序构建的系统进化树真实反应了物种间进化关系。