猪ESRRB启动子克隆及其调控活性检测

Esrrb(Estrogen related receptorβ)属于雌激素受体家族,是一类在胚胎早期外胚层细胞中表达并对干细胞多能性维持起重要作用的基因。为了探索猪ESRRB的表达和转录调控机制,克隆了3.3 kb ESRRB启动子片段,构建了相应的报告载体。并将报告载体分别转染293T人胚肾细胞、Hela人宫颈癌细胞和小鼠C2C12成肌细胞。通过TFSEARCH和JASPER方法对ESRRB启动子潜在的转录调控位点进行分析,发现该启动子上有SMAD、STAT3、MYC、KLF4等多能转录因子的结合位点。将相应的转录因子与ESRRB启动子共转染,并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示猪ESRRB启动子具有明显的组织特异性调控,同时SMAD对ESRRB启动子活性有较明显的调控作用。进一步对3.3 kb片段进行了一系列的缺失,发现猪ESRRB核心区域位于5′上游的-25 bp和-269 bp之间。研究结果表明猪ESRRB启动子上潜在的转录因子结合位点及启动子核心区域是参与调控ESRRB表达的重要序列。     

人细胞周期相关激酶启动子的克隆和初步分析

克隆人的细胞周期相关激酶(CCRK)基因启动子,分析与其表达有关的转录调控因子。通过巢式PCR方法,从人的基因组总DNA中分离出CCRK基因5′端非翻译区大小为1072bp的片段。这段片段的3′端起始点在第一个外显子里第一个翻译密码子ATG( 1)上游128bp处。以1072bp为模板,对启动子进行5′端删除分析,分别扩增951bp(-1072／-128)、564bp(-692／-128)、313bp(-441／-128)、127bp(-239／-128)的片段,与pGL3-Basic荧光素酶报告载体重组构建,人工加上克隆位点,5′端带有KpnI、3′端带有XhoI位点。瞬时转染恶性神经胶质瘤细胞株U373,通过双荧光素酶活性进行分析。对分离出的1072bp的片段进行测序,结果与GenBank(Accession AF035013)的序列比较,同源序列达到98％。双荧光素酶活性分析564bp片段有最强的活性,313bp片段为有活性的最小片段。本研究为进一步研究分析CCRK的核心启动子和与其相关的转录因子奠定基础。     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

人类RELM-beta基因启动子的结构与功能分析

为克隆人类抵抗素样分子β（resistin-like molecule beta, RELMβ）基因的上游启动子序列,并观察其不同截短片段的启动子活性,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得-871～+50 bp、-729～+50 bp、-471～+50 bp、-438～+50 bp、-371～+50 bp大小的RELMβ启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子CDX-2结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染人胚肾293细胞、结肠癌HCT116和SW480细胞、宫颈癌HeLa细胞.结果发现,各RELMβ启动子片段在293、HCT116、SW480细胞中均有活性,但在HeLa细胞中活性缺失;-471～-438 bp区存在RELMβ启动子的核心调控元件.针对该区域CDX-2转录因子结合位点进行突变,能导致RELMβ启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合CDX-2.结果提示,成功克隆了具有活性的RELMβ启动子序列,CDX-2为其重要的转录因子,为研究RELMβ基因的转录调控机制奠定了实验基础.     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体(FXR)基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,-1651~ 200、-1496~ 200区域的启动子活性无明显区别,-847~ 200区域的启动子活性最高,-544~ 200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在-847~-544范围内.     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

猪精浆蛋白基因PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ启动子序列克隆及生物信息学分析

分别用PCR方法扩增了1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子,并进行TA克隆,测序鉴定,测序结果用DNAstar程序与Genebank中的相应序列进行对比分析,结果显示与已发表序列的同源性分别为99.8%和96.3%。利用生物信息学的方法对克隆的1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子区进行了预测分析。PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因序列对比(mVista)分析发现,启动子0→-1000bp的保守性较高,其中0→-200bp核心启动子部分的序列同源性达到了100%,而-1000bp上游序列的保守性则较低。启动子的位置预测(Promoter Scan)结果显示,转录起始点上游200bp的区域为两基因的核心启动子位置。启动子区转录因子结合位点预测(TFSEARCH)发现,转录起始位点上游的1000bp区域内含有大量的顺式调控元件,并且得到了一系列潜在的转录因子结合位点。     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

非病毒基因治疗的研究进展

非病毒基因治疗是相对于病毒性基因治疗而言,指采用非病毒的载体进行的基因治疗。非病毒的基因载体比病毒性基因载体具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特点。本文就非病毒基因治疗所采用的主要方法、面蜂的主要问题及发展方向作一概括的介绍。随着人类对疾病发病分子机制的深入研究及人类基因组计划的实施,非病毒基因治疗将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。     

BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.     

杆状病毒凋亡抑制基因的研究进展

杆状病毒(bacu lovirus)感染昆虫细胞能引起细胞凋亡,但在长期进化过程中,杆状病毒可通过自身编码凋亡抑制基因的表达,抑制细胞凋亡以利于自己的增殖。目前在杆状病毒基因组中已发现两种不同类型的细胞凋亡抑制基因p35/p49和iap,这两类凋亡抑制基因分别作用于细胞凋亡途径的不同位点,以抑制细胞的凋亡。近年来人们对这两种基因的蛋白结构及作用机制等方面进行了大量的研究,这些为今后研究昆虫细胞凋亡,扩大杆状病毒宿主范围等方面奠定了基础。