电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ-内毒素基因导入野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导入几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数,计算出转化效率为10~1—10~4转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

地衣芽胞杆菌dif序列的功能鉴定

地衣芽胞杆菌是重要的工业菌株,如何为其建立一种有效的基因删除技术是对该菌株进行遗传改良的基础。枯草芽胞杆菌difB8序列已经被成功用于枯草芽胞杆菌多基因的删除。在分析地衣芽胞杆菌基因组序列并获得与枯草芽胞杆菌difB8以。序列十分相似的一段序列difBLi的基础上,构建了在庆大霉素抗性基因两侧具有difBLi的重组质粒pMD19-difGm和pHY-XI’：：difGm,通过电击转化法将质粒pHY-XI’：：difGm导入B．1icheniformis ATCC14580中,筛选获得了具有庆大霉素抗性的转化子。在转化子的传代过程中,重组质粒的庆大霉素抗性基因在体内Xer／dif／f位点特异性重组系统的介导下通过其侧翼的dif位点进行同源重组而被准确删除。确证了地衣芽胞杆菌中dif序列的功能,为地衣芽胞杆菌基因组中多基因的删除提供了一种新的实验途径。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl2/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

黑曲霉糖化酶基因启动子区的克隆及其功能测定

利用PCR技术,以黑曲霉糖化酶高产株T21的基因组DNA为模板合成了糖化酶基因5＇端上游850bp的非编码区,并作了序列测定。将该合成片段与细菌潮霉素磷酸转移酶结构基因融合建成表达质粒,转化黑曲霉,获得了高潮霉素抗性转化子,证实该合成片段具有丝状真菌启动子功能。抗性转化子的Southern分析表明,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到受体黑曲霉的基因组DNA中。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

以质粒pKF3为模板,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,连至pMD18T载体,构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh,与pMD18PC连接,得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切,回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段,电转化至JM109/pKD46,在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组,将基因ptsG敲除,替换为catsdh基因,获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物,JM109s基因组DNA为模板进行PCR,扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。     

大肠杆菌抗药性质粒pFD3的链霉素抗性表达

Cohen等‘31研究大肠杆菌抗药性质粒R6 （此质粒携带卡那霉素、新霉素、氯霉素、四环 素、链霉素抗性）,发现在用卡那霉素抗性、新 霉素抗性或氯霉素抗性作为选择性标记进行转 化时,极少数转化子失掉链霉素抗性。本文报 道大肠杆菌抗药性质粒pFD 3（此质粒携带四 环素、链霉素、氯霉素、氨苇青霉素、磺胺抗性） 在经结合转移或转化途径传递给大肠杆菌C'₆₀₀ 时,所得的转移子、转化子中四环素、氯霉素、氨 苇青霉素及磺胺抗性都能正确表达,而链霉素 抗性则不能完全表达。     

运用萎锈灵抗性基因构建香菇聚乙二醇介导的遗传转化方法

【背景】萎锈灵抗性基因作为筛选标记在植物和真菌中得到广泛应用。【目的】构建可以使用萎锈灵作为筛选标记的香菇遗传转化技术。【方法】利用溶壁酶消化培养4 d的香菇菌株411-4的菌丝体获得原生质体,加入适量pL-cbx质粒和聚乙二醇溶液,混合物涂布于再生筛选培养基上,培养后挑选菌落进行验证试验。【结果】在原生质体数目108个和添加4μg质粒DNA的情况下,得到了40个抗性转化子。利用PCR实验和转代实验对转化子进行验证,结果显示38个转化子的抗性可稳定遗传,表明萎锈灵抗性基因整合进入了供试菌株的基因组中。【结论】利用香菇411-4菌株建立了一套运用萎锈灵抗性基因作为分子标记的遗传转化技术体系。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。     

海洋微生物信号降解酶基因aiiA克隆与表达载体的构建

根据已知的微生物信号降解酶基因aliA的序列设计、合成特异性引物探针,以从海洋分离的微生物ZD02的基因组为模板,PCR扩增编码蛋白alia信号降解酶的基因aliA序列,产物经PCR验证后用于构建克隆载体pMD18-ZD02aiiA,并以此克隆载体为模板,以带酶切位点的引物扩增基因,经BamHI和EcoRI双酶切后将其插入表达载体pET-17b,构建原核表达质粒pET—ZD02aiiA。经酶切、PCR鉴定及序列测定等,结果表明：克隆基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框正确,为海洋微生物ZD02信号降解酶基因的体外重组和诱导表达研究打下基础。     

含CSFV E2基因A/D区原核表达载体的构建、表达及其抗原性研究

应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。     

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSBl细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA(chicken telomerase RNA,chTR)全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列.序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465 bp,其中模板区的11个核苷(5'-CUAACCCUAAU-3')合成端粒亚单位(TTAGGG)n.chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核表达

因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列（GenBank L12145）设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长3 466bp的片段,然后将其克隆到pMD18T中,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET28b后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,经Western blotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。