链霉菌启动子的研究Ⅰ.灰色链霉菌启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

灰色链霉菌(streptomyces griseus)No.45是链霉素产生菌,用于工业规模的链霉素生产,其启动子结构及基因表达的调控尚未揭示。本文报道了S.riseus启动子在大肠杆菌(Escherichia coil)中的克隆和表达,证实了S.griseus中也存在E.coli类型的启动子。我们已将S.griseus DNA的PstⅠ、BglⅡ酶切片段克隆到启动子探测质粒pGA46上,在大肠杆菌中表达四环素抗性基因启动子的功能。S.griseus DNA的Hin dⅢ酶切片段也已经克隆到另一个启动子探测质粒pPV33-H上,在E.coli中表达四环素抗性基因启动子的功能。为了进一步验证和分析,将重组质粒和载体以限制性内切酶酶切,从电泳图谱中可以重新找到共同的载体区带。以DNA分子杂交的方法进行DNA同源性分析,结果表明载体pGA46或pPV33-H和S.griseus DNA没有可察觉的杂交区带,而重组质粒和S.griseus DNA及载体均有明显的杂交区带。这说明重组质粒中的外源插入序列确是来自S.griseus,这些DNA片段携带了四环素抗性基因的启动子。为了进一步分析启动子功能区域的结构,已将重组质粒No.8中4.24kb的S.griseus插入序列缩短到1.89kb。插入序列的继续缩小正在进行中。     

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍对短小芽孢杆菌AS 1.271菌株的诱变作用

1. MNNG在 pH6时较为稳定,在碱性条件下分解极为迅速,较易受光照作用而分解。 2．MNNG诱发短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) AS 1.271 菌株获得最高突变率的适宜条件是：菌龄为对数生长期的早期,采用0．05M pH6的TM缓冲液,所用剂量为1000微克／ 毫升,于30℃处理45分钟,在这样的处理条件下,营养缺陷型突变菌株可达20％左右。 3．在所获得的1775株突变菌株中,有947株经过营养缺陷型的鉴定,其中有核酸碱基、氨基酸、维生素的单一和双重营养缺陷型突变体,核酸碱基缺陷型中,腺嘌呤缺陷型较多,氢基酸缺陷型中以组氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、精氨酸等缺陷型所占的比例较大。     

链霉素产生菌——灰色链霉菌质粒的分离和电镜观察

链霉素产生菌——灰色链霉菌(Streptomyces griseus)No.45经36℃处理后,获得了气生菌丝生长受抑制的突变体,这些高温突变体全部丧失了合成链霉素的能力。从遗传学上验证表明:灰色链霉菌中分离得到质粒DNA(SGPI),并用电镜进行了观察证实。     

分予克隆链霉菌抗生素生物合成的整个途径以及它们在异源寄主中的表达

在产生抗生素的微生物上采用分子克隆将会导致抗生素产量的增加,同时通过种间体外重组将导致合成新的抗生素,~2为此目的,应将抗生素合成基因分离出来,进行分析,并可能还要修饰。链霉菌的一些种产生几乎已知抗生素的三分之二。最近在这个属内发展起来的克隆系统使得有可能分离并分析链霉菌的基因了。然而,抗生素是     

灰色链霉菌质粒编码链霉素生物合成有关基因的研究

链霉素是由链霉糖、链霉胍和N甲基一L一葡萄糖胺三部分组成。我们证明了经高温消除质粒后不产链霉素的突变株不能合成链霉胍。在补加外源链霉胍、链霉胍磷酸酯酶、并有ATP和Mg~(2 )存在的条件下,由链霉胍磷酸酯酶催化外源链霉胍转变为O-磷酸链霉胍,进入链霉素的正常生物合成途径后产生链霉素。本文证明了灰色链霉菌质粒编码链霉胍磷酸酯酶的基因以及链霉胍合成的有关基因。     

24株产不同抗生素的放线菌质粒的分离和鉴定

分离鉴定了中国微生物菌种保藏管理委员会保藏的24株产不同抗生素的放线菌的质粒。按改进的Kado和Liu快速法提取质粒DNA,经电泳、电镜的检测,在24株检测菌中的7株菌里分离出10个质粒,携带质粒的菌株约占检测菌株的29％。质粒DNA的分子量约为1.8—61.6 kb。通过消除质粒试验和致死接合(Ltz)反应,研究了质粒和抗生素产生的关系。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

乳链菌肽产生菌的定向筛选及发酵产物的鉴定

利用乳链菌肽产生菌中nip^+nis^rsuc^+紧密连锁的原理,在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上,从牛奶样品中定向筛选乳链菌肽产生菌。对筛选到的L. lactis1409菌株发酵产物的分析鉴定结果揭示:该产物对多种革兰氏阳性菌有强烈抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无效,在pH值低的条件下对热稳定,对α—胰凝乳蛋白酶敏感,具有生物活性的蛋白质的分子量与乳链菌肽相当,而1409菌株的质粒分布与L. laclisATCC11454和L. lactis 7962不同,说明筛选到的L. laclis 1409菌株确是一株新的乳链菌肽产生菌。