缺失宿主Vta1蛋白的MIT结构域对杆状病毒AcMNPV复制的影响

【目的】克隆草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Vta1基因,检测Vta1在苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)复制中的作用。【方法】利用反转录-PCR与PCR方法筛选草地贪夜蛾Vta1基因及缺失Vta1N-端MIT结构域的突变体并构建其瞬时表达质粒,通过转染Sf9细胞检测表达;构建Vta1及其突变体的双分子荧光互补表达质粒,并通过瞬时转染检测其与Vps4及ESCRT-III亚基Vps46与Vps60的相互作用;共转染gp64与Vta1及其突变体瞬时表达质粒,检测瞬时表达Vta1突变体对AcMNPV出芽型病毒产量及病毒基因启动子指导报告基因表达的影响。【结果】获得了草地贪夜蛾Vta1基因。氨基酸序列相似性分析表明,昆虫、酵母与人类Vta1同源蛋白的相似性分别约为20%与50%。Western blotting分析表明GFP标签的Vta1及其突变体均能在瞬时转染的Sf9细胞中表达。双分子荧光互补分析发现,缺失第1个或第2个MIT结构域显著降低Vta1突变体与Vps4、Vps46或Vps60的相互作用。此外,瞬时表达Vta1突变体显著降低了AcMNPV感染性出芽型病毒的产量,但并未影响AcMNPVie1基因早期启动子和p6.9基因晚期启动子指导的LacZ和GUS报告基因的表达。【结论】Vta1可能参与杆状病毒AcMNPV子代病毒粒子的组装和/或出芽释放过程。     

斜纹夜蛾核多角体病毒Spit119基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF119全长基因(Splt119),将其克隆至5'端有6 × His编码序列的原核表达栽体pQE30上,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/LIPTG诱导下超量表达了一个分子量约28 kD的融合蛋白.经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,免疫新西兰大白兔制备了特异的抗Splt119抗体.Western blotting免疫印迹分析表明,该抗体适合用作Splt119蛋白功能的进一步研究.     

斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

内吞体分选转运复合体 (ESCRT) 及其在包膜病毒出芽中的作用

内吞体分选转运复合体(Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)主要识别泛素化修饰的膜蛋白,介导内吞小泡出芽和多泡体(Multivesicular bodies,MVBs)的形成。此外,以类似的拓扑方式,ESCRT也参与胞质分裂、自体吞噬、以及包膜病毒的出芽等过程。已有的研究表明,大量的反转录病毒和RNA病毒含有晚期结构域(Late-domains),该结构域与ESCRT组分相互作用,将ESCRT-Ⅲ和VPS4等募集在病毒组装与出芽区域,并利用ESCRT-Ⅲ使病毒粒子得以释放。最近,有研究发现,一些DNA包膜病毒、如乙肝病毒、疱疹病毒和杆状病毒等的出芽释放也依赖于宿主细胞ESCRT系统,但其机理尚需深入研究。     

昆虫病毒gp37/fusolin基因研究进展

昆虫病毒gp37fusolin基因属病毒复制非必需基因,其编码的蛋白能形成一种纺锤形包涵体(spindlebodies,SBs),该包涵体内不含有病毒粒子。Fusolin蛋白形成的SBs与纯化的Fusolin蛋白均能提高靶昆虫对杆状病毒的敏感性,推测GP37蛋白也具有类似的功能。对gp37fusolin基因的深入研究,有可能开发出新型病毒增效剂 。     

杆状病毒Ac60基因的原核表达与亚细胞定位研究

用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到ORF60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pETAc60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白.用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞(Si9)中ORF60基因的表达,结果显示:在感染后的细胞中有2条分子量分别约为33 ku和17 ku蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应.间接免疫荧光分析发现:在病毒感染的晚期,Ac60蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中.     

杆状病毒基因Ac108的克隆和原核表达

目的:克隆和表达苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa califorica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)开放阅读框108(open reading frame,ORF108,Ac108)基因,为进一步研究其功能打下基础.方法:将Ac108基因克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中表达AC108蛋白.以纯化的AC108蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔制备蛋白的多克隆抗体.用该抗体检测了该蛋白在病毒感染细胞中的表达.结果:实现了AC108蛋白的表达,获得了AC108蛋白的多克隆抗体,Western blot检测发现在AcMNPV感染的Sf-9细胞中有一条大小约为27kDa的杂交带,远大于预期的11kDa.结论:AC108蛋白可能以同源或异源聚合物形式在电场中迁移.     

甜菜夜蛾cDNA文库的构建

以甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)幼虫为材料建立了cDNA表达文库,经检测文库的初始滴度为1.1×105pfu/mL,重组率为97%,扩增后文库的滴度为5.4×107pfu/mL。用设计的2对引物筛选该文库,得到468 bp的1个片段,分析后证实是几丁质合成酶基因I保守区域的1个片段。该cDNA文库为进一步筛选甜菜夜蛾功能基因奠定了基础。     

甜菜夜蛾核多角体病毒(SeMNPV)ORF100和ORF101基因的克隆、表达与纯化

目的构建甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)ORF100(Se100)和ORF101(Se101)基因的原核表达载体,表达并纯化两种蛋白.方法用PCR方法扩增Se100和Se101基因,分别将它们克隆至原核表达载体pQE-30上,转化宿主菌M15[pREP-4],用IPTC进行诱导表达,表达产物用Ni-NTA金属螯合层析法进行纯化,SDS-PAGE检测表达的目的蛋白.结果构建了分别含有Se100和Se101基因的原核表达质粒pQE100和pQE101;SDS-PAGE检测显示,表达的两个融合蛋白的分子量分别为15kDa和31kDa,比预期分子量稍大;Ni-NTA亲和层析结果显示6×His-Se100和6×His-Se101融合蛋白主要存在于pH值为4.5的缓冲液中.结论成功克隆并高效表达了Se100和Se101两个基因,有效纯化了两种蛋白,为深入进行基因的功能研究奠定了基础.     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。