NFY结合位点缺失下调NPCEDRG基因启动子转录活性和效率

NPCEDRG基因是一个鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)相关基因. NPCEDRG基因启动子为TATA-less启动子,其核心启动子区域位于-146 ～-8 bp区,该区域包含NFY、STAT1和cMYB等转录因子结合位点. 前期研究结果提示,转录因子NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控. 为明确NFY转录因子在NPCEDRG基因转录中的作用,本研究应用报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因核心启动子区进行NFY结合位点（或CCAAT-box）缺失突变及其功能分析,分别构建NPCEDRG基因核心启动子区NFY结合位点缺失突变的Luc和EGFP报告基因表达载体. 比较核心启动子和NFY结合位点缺失突变体报告基因载体的转录活性和效率. 结果表明,在MCF7和CNE2细胞中,NFY结合位点缺失突变体的转录活性分别约为其核心启动子转录活性66.94%和75.72%,即NFY结合位点缺失致使该启动子转录效率在MCF7和CNE2细胞中分别降低了33.06%和24.28%;EGFP报告基因表达载体系统研究结果与Luc报告基因载体系统结果基本吻合. 本研究再次证实,转录因子NFY通过结合NPCEDRG基因启动子的核心元件NFY结合位点参与NPCEDRG基因的转录调控,并提高其基因转录活性和效率.     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

人NPCEDRG基因启动子的克隆及CCAAT/NFY结合位点初步分析

NPCEDRG基因是采用基因定位候选克隆策略获得的一个鼻咽癌候选抑瘤基因.NPCEDRG在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,重新恢复NPCEDRG基因在CNE2细胞系的表达,可部分逆转CNE2的恶性表型.为揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,联合应用生物信息学和报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因启动子区进行克隆及功能分析,系统发育进化足迹分析结果表明,NPCEDRG基因5′端调控区-180～+235 bp区间在脊椎动物中高度保守,该保守区域中存在包括CCAAT/NFY、STAT1和SP1等转录因子结合位点.构建Luc和/或EGFP报告基因表达载体并检测其启动子活性,-146～-8 bp区域有较强的启动子活性,电泳迁移阻滞分析实验(EMSA)提示,CCAAT/NFY转录因子结合位点是NPCEDRG基因的转录调控元件.因此,研究确定-146～-8 bp区域是NPCEDRG基因核心启动子区域且启动子核心元件CCAAT/NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控.     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

人类RELM-beta基因启动子的结构与功能分析

为克隆人类抵抗素样分子β（resistin-like molecule beta, RELMβ）基因的上游启动子序列,并观察其不同截短片段的启动子活性,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得-871～+50 bp、-729～+50 bp、-471～+50 bp、-438～+50 bp、-371～+50 bp大小的RELMβ启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子CDX-2结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染人胚肾293细胞、结肠癌HCT116和SW480细胞、宫颈癌HeLa细胞.结果发现,各RELMβ启动子片段在293、HCT116、SW480细胞中均有活性,但在HeLa细胞中活性缺失;-471～-438 bp区存在RELMβ启动子的核心调控元件.针对该区域CDX-2转录因子结合位点进行突变,能导致RELMβ启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合CDX-2.结果提示,成功克隆了具有活性的RELMβ启动子序列,CDX-2为其重要的转录因子,为研究RELMβ基因的转录调控机制奠定了实验基础.     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

人肝内胆管癌细胞PRL-3 的表达与侵袭转移研究

目的:探讨PRL-3在人肝内胆管癌侵袭转移中的作用.方法:利用小RNA技术干扰肝内胆管癌细胞株PRL-3表达,并采用细胞划痕实验和Transwell体外侵袭实验评价PRL-3对肝内胆管癌细胞侵袭转移能力的影响.结果:RT-PCR和Western blot结果均显示转染PRL-3特异性siRNA-2组PRL-3表达明显降低(P＜0.05).PRL-3 siRNA-2组在划痕培养24h后划痕区域宽度占初始划痕区域宽度的百分比为(62.12±6.28)％,阴性对照组为(23.88±2.55)％,空白对照HCCC-9810组为(21.20±6.07)％.PRL-3siRNA-2组细胞的划痕两端距离相比明显较宽,分别与阴性对照组细胞和空白对照HCCC-9810组细胞相比均有统计学意义(P＜0.05),后两者无显著性差异(P＞0.05).Transwell体外侵袭实验结果显示,PRL-3 SiRNA-2组细胞侵袭能力明显减弱,穿膜细胞数为(19.40±2.30)个/HP,明显少于阴性对照组(64.00±2.73)个/HP和正常HCCC-9810组(67.20±3.l1)个/HP,差异有显著性(P＜0.05);正常HCCC-9810组和阴性对照组无明显差异(P＞0.05).结论:PRL-3特异性siRNA能够抑制肝内胆管癌细胞HC-CC-9810中内源性PRL-3的表达,并可以明显抑制肝内胆管癌细胞的迁移侵袭能力.     

Rhodanine-based PRL-3 inhibitors blocked the migration and invasion of metastatic cancer cells

PRL-3, phosphatase of regenerating liver-3, plays a role in cancer progression through its involvement in invasion, migration, metastasis, and angiogenesis. We synthesized rhodanine derivatives, CG-707 and BR-1, which inhibited PRL-3 enzymatic activity with IC₅₀ values of 0.8 μM and 1.1 μM, respectively. CG-707 and BR-1 strongly inhibited the migration and invasion of PRL-3 overexpressing colon cancer cells without exhibiting cytotoxicity. The specificity of the inhibitors on PRL-3 phosphatase activity was confirmed by the phosphorylation recovery of known PRL-3 substrates such as ezrin and cytokeratin 8. The compounds selectively inhibited PRL-3 in comparison with other phosphatases, and CG-707 regulated epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) marker proteins. The results of the present study reveal that rhodanine is a specific PRL-3 inhibitor and a good lead molecule for obtaining a selective PRL-3 inhibitor.     

探寻肝再生磷酸酶3在膀胱癌细胞T24中的作用

目的：已经有研究证明肝再生磷酸酶3（PhosphataseofRegeneratingLiver-3,PRL-3）在消化道肿瘤的发生发展过程中起到重要作用,但其在膀胱癌中发挥何种作用尚不清楚,本次研究主要探寻PRL-3在膀胱癌细胞T24中作用,以求为膀胱癌的治疗提供新思路。方法：采用siRNA干涉的方法下调T24中PRL-3蛋白表达水平,通过westernblot方法检测干涉效果,绘制细胞生长曲线、构建裸鼠种植瘤模型,检测PRL-3下调对细胞体外及体内增殖的影响。结果：我们所设计的siRNA能够下调PRL-3在A498细胞中的表达（F=7．26,P〈0．05）,细胞生长曲线显示下调PRL-3能够抑制细胞的增殖,这种作用从干涉后的第60h开始,随时间增加作用愈加明显（F≥8．35,P〈0．05）;动物实验表明,siRNA下调PRL-3能够抑制T24细胞在活体内的增殖,从干涉后第21天开始这种作用开始体现出来（F≥10．46,P〈0．05）,并且干涉组的肿瘤肿瘤明显低于两个对照组（F=13．63,P〈0．05）。结论：我们构建的siRNA能够在T24细胞中实现对PRL．3蛋白的下调,siRNA介导的PRL-3蛋白下调能够明显抑制T24细胞在活体外及活体内的增殖,这初步证明PRL-3在膀胱癌中发挥重要的作用。随着我们对PRL-3分子进一步深入的了解,揭示其发挥作用的具体机制,PRL-3很可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。     

PRL-3在乳腺癌中的表达及意义

目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌血管形成和临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测72例乳腺癌石蜡包埋组织,WesternBlot方法检测15例新鲜乳腺癌组织及5例癌旁乳腺组织中PRL-3的表达情况,并应用χ2检验和t检验等方法分析PRL-3在乳腺癌组织中表达的意义及其与临床病理特征之间的关系。结果免疫组化结果显示PRL-3表达定位于乳腺癌组织和癌旁乳腺组织的细胞质,间质无着色。癌组织与癌旁乳腺组织的阳性率为分别为69·4%和35%,癌组织中PRL-3的表达明显高于癌旁组织,具有统计学意义(P=0·005)。统计分析显示,PRL-3的表达与临床分期(P=0·001)、淋巴结转移(P=0·008)呈明显正相关,R值分别为0·360和0·299;而与患者的年龄、性别、家族史、肿瘤大小、ER、PR和C-erBb-2阳性率无明显关系。WesternBlot结果亦证实PRL-3在乳腺癌中的表达较癌旁乳腺组织明显增高(P=0·044),且有淋巴结转移组表达高于无淋巴结转移组(P=0·040)。72例乳腺癌中,PRL-3蛋白阳性组MVD的均值高于PRL-3阴性组,两者之间差异显著(P=0·001)。结论PRL-3的表达水平在一定程度上提示乳腺癌的转移潜能,并可能通过促进肿瘤血管形成来促进乳腺癌的生长和转移。     

Identification of integrin alpha1 as an interacting protein of protein tyrosine phosphatase PRL-3

PRL-3 is a newly identified protein tyrosine phosphatase associated with tumor metastasis. It is over-expressed in various cancers, such as colorectal cancer, gastric cancer, and ovarian cancer, and is correlated with the progression and survival of cancers. Although PRL-3 plays a causative role in promoting cancer cell invasion and metastasis, the molecular mechanism is unknown. To investigate PRL-3's roles in tumorigenesis and signal transduction pathway, we screened the human placenta brain cDNA library with the bait of PRL-3 in yeast two-hybrid system. Then we identified integrin alpha1 as a PRL-3-interacting protein for the first time, and verified this physical association with pull-down and co-immunoprecipitation assays. Furthermore, we found that PRL-3 could down-regulate the tyrosine-phosphorylation level of integrin beta1 and increased the phosphorylation level of Erk1/2. Our present discovery will provide new clues for elucidating the molecular mechanism of PRL-3 in promoting cancer invasion and metastasis.     

Inhibition of PRL-3 gene expression in gastric cancer cell line SGC7901 via microRNA suppressed reduces peritoneal metastasis

High expression of PRL-3, a protein tyrosine phosphatase, is proved to be associated with lymph node metastasis in gastric carcinoma from previous studies. In this paper, we examined the relationship between PRL-3 expression and peritoneal metastasis in gastric carcinoma. We applied the artificial miRNA (pCMV-PRL3miRNA), which is based on the murine miR-155 sequence, to efficiently silence the target gene expression of PRL-3 in SGC7901 gastric cancer cells at both mRNA and protein levels. Then we observed that, in vitro, pCMV-PRL3miRNA significantly depressed the SGC7901 cell invasion and migration independent of cellular proliferation. In vivo, PRL-3 knockdown effectively suppressed the growth of peritoneal metastases and improved the prognosis in nude mice. Therefore, we concluded that artificial miRNA can depress the expression of PRL-3, and that PRL-3 might be a potential therapeutic target for gastric cancer peritoneal metastasis.     

苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建

[目的]通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体.[方法]利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性.通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证.[结果]构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E＞Pcry1A＞Pcry4A＞Pcry3A.选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73-,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac.扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因.SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b.对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac.[结论]利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b.