IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究

目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1;pS2）;采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3．Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中,48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5）,并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物（EMMPRIN）基因转录的影响。方法：构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果：HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为＋1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论：HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

热休克转录因子1对高迁移率族蛋白B1的转录调控作用及机制

目的：探讨烧伤血清诱导下热休克转录因子1（HSF1）对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的转录调控作用及其机制.方法：构建热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1,HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y,HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T.pcDNA3.1-HSF1转染巨噬细胞RAW264.7,烧伤血清诱导后,半定量RT-PCR检测HMGB1 mRNA的表达.pcDNA3.1-HSF1,HMGB1启动子荧光素酶报告基因共转染RAW264.7,烧伤血清诱导后,检测并比较pGL3-HMGB1-Y和 pGL3-HMGB1-T的相对萤光素酶活性.结果：烧伤血清诱导下,HSF1可以下调RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.pGL3-HMGB1-T的相对荧光素酶值较pGL3-HMGB1-Y明显下降,P＜0.01,差异有显著统计学意义.结论：烧伤血清诱导下,HSF1可能通过与HMGB1启动子区HSE的结合下调小鼠巨噬细胞RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

Strict Regulation of Gene Expression Utilizing a Dual-control Gene Expression Vector System

可严格调控性是体现原核表达载体优越性的重要指标。构建了一种双控双调节原核表达载体系统,用双载体控制调节目的基因的表达,即SP6启动子（promoter）＋乳糖（lac）调节基因表达系统和araB启动子（promoter）＋ara C调节基因表达系统,分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖（L-arabinose）诱导目的基因的表达。该系统由2个表达载体共同完成目的基因的表达。pE SP-1为主表达载体,即目的基因克隆到此表达载体上,由SP6启动子（promoter）＋乳糖（lac）调节基因调控;pA RA-SP6为辅助表达载体,该载体通过SP6 RNA聚合酶的表达来控制调节主表达载体的启动子（SP6）,由araB启动子（promoter）＋ara C调节基因调控。实验结果显示该双控双调节表达载体系统控制严格,并且表达蛋白的量具有可调控性。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

miR-181b-5p 对于卡波西肉瘤细胞SLK细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降。     

大鼠SCN5A基因内含子1＋204bp～＋757bp转录调控功能分析

目的 克隆大鼠心肌SCN5A基因5’端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法 扩增大鼠心肌SCN5A基因＋204bp-＋757bp、＋204bp-＋385bp和＋204bp-＋329bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性。结果 成功构建大鼠心肌SCN5A基因5’端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-PO、pGL3-P2的4．3倍和2．8倍。结论SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因＋329bp～＋385bp为正调控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控。     

Dppa2 基因启动子区Oct4 结合位点突变对其活性的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

MMP-7基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达与鉴定

目的：构建MMP-7基因真核重组质粒,检测并鉴定MMP-7在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法：提取宫颈癌组织总RNA,通过基因克隆构建MMP-7基因真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7,酶切、PCR及基因测序鉴定,用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR检测外源基因的表达、间接免疫荧光法检测对表达产物进行鉴定。结果：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7并转染了人宫颈癌Hela细胞,通过RT-PCR可以检测到MMP-7 mRNA在Hela细胞中的表达,经间接免疫荧光反应可检测到明显的阳性反应,而转染空载体组表达阴性。结论：构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7能在Hela细胞中表达,为该蛋白在人子宫癌后续的功能研究奠定了基础。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。