分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP),是Hsp70(70 kilodalton heatshock proteins)蛋白家族的成员之一,是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要的调节器。为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,首先,分析BiP的DNA序列和蛋白质空间构象,接着利用重叠PCR方法分别克隆ATPase结构域缺失体和peptide-binding结构域缺失体(BiPa和BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,转染LO2细胞和SMMC-7721细胞,应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达;运用MTT法、BrdU免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡;检测BiP及两个组成结构域对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。酶切、电泳和DNA测序结果显示,BiP全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功;免疫印迹检测到BiP三种真核载体在LO2细胞和SMMC-7721细胞中均能正确表达;MTT和BrdU免疫组化结果表明,BiP全长和缺失体BiPa、BiPp三种真核载体均能有效促进SMMC-7721的增...     

川崎病患儿血浆中可溶性内皮细胞蛋白C受体、一氧化氮的表达及与炎症反应和冠状动脉病变的关系

目的:研究川崎病患儿血浆中可溶性内皮细胞蛋白C受体(s EPCR)、一氧化氮(NO)的表达及与炎症反应和冠状动脉病变(CAL)的关系。方法:选择2016年12月至2018年2月盘锦市中心医院收治的川崎病患儿104例为川崎病组,根据患儿彩色超声心动图检测结果将川崎病组分为CAL组30例和非CAL组(NCAL组)74例。另选取同期于我院进行体检的健康儿童56例为对照组。比较川崎病组与对照组、川崎病组患儿急性期与缓解期、CAL组与NCAL组s EPCR、NO、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并分析川崎病患儿s EPCR、NO与炎症因子及CAL的相关性。结果:川崎病组患儿s EPCR、NO、CRP、IL-6、TNF-α水平均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。川崎病组患儿急性期s EPCR、NO、CRP、IL-6、TNF-α水平均高于缓解期,差异有统计学意义(P0.05)。CAL组s EPCR、NO、CRP、IL-6、TNF-α水平均高于NCAL组,差异有统计学意义(P0.05)。经Pearson相关性分析结果显示,川崎病患儿s EPCR、NO与CRP、IL-6、TNF-α及CAL均呈正相关(P0.05)。结论:川崎病患儿s EPCR、NO水平与炎性因子及CAL相关,s EPCR、NO可能在其炎症反应及CAL进展中起到一定的作用。     

IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究

目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1;pS2）;采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3．Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中,48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5）,并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。     

IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果 酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

左西孟旦联合呋塞米治疗顽固性心力衰竭的疗效分析

目的:探讨左西孟旦联合呋塞米治疗顽固性心力衰竭的疗效。方法:选取了80例顽固性心力衰竭患者,按随机数字表法分为两组对照组(39例)给予左西孟旦注射液,观察组(41例)给予左西孟旦联合呋塞米治疗后24 h,通过观察并记录治疗后的疗效,治疗前后心搏量(SV),左室射血分数(LVEF)和N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)水平及随访3 d内不良反应情况,评价左西孟旦联合呋塞米治疗顽固性心力衰竭的疗效。结果:治疗后观察组患者心功能改善1级以上患者共37例,对照组28例,观察组有效率明显高于对照组(P0.05),治疗前,两组SV,LVEF,NT-proBNP无统计学差异(P0.05),治疗后,两组SV和LVEF水平均增加,且观察组高于对照组治疗后,两组NT-proBNP水平均降低,且观察组明显低于对照组(P0.05),随访3d,两组不良反应率相比,无统计学差异(P0.05)。结论:采用左西孟旦联合呋塞米对顽固性心力衰竭具有较好的治疗效果,能有效增强心脏收缩力,提高心输出量,减轻心力衰竭程度。