分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP),是Hsp70(70 kilodalton heatshock proteins)蛋白家族的成员之一,是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要的调节器。为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,首先,分析BiP的DNA序列和蛋白质空间构象,接着利用重叠PCR方法分别克隆ATPase结构域缺失体和peptide-binding结构域缺失体(BiPa和BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,转染LO2细胞和SMMC-7721细胞,应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达;运用MTT法、BrdU免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡;检测BiP及两个组成结构域对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。酶切、电泳和DNA测序结果显示,BiP全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功;免疫印迹检测到BiP三种真核载体在LO2细胞和SMMC-7721细胞中均能正确表达;MTT和BrdU免疫组化结果表明,BiP全长和缺失体BiPa、BiPp三种真核载体均能有效促进SMMC-7721的增...     

IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究

目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1;pS2）;采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3．Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中,48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5）,并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果 酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.     

转录因子XBP1S基因表达谱差异分析

目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1（-）-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1（-）处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1（-）-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.