带有穿膜肽重组PTD-Sox2的制备及活性鉴定

目的:制备带有穿膜肽的重组蛋白PTD-Sox2并对其活性进行鉴定.方法:通过将Sox2基因与穿膜肽基因PTD融合,利用原核表达载体pKYB进行表达,用Ni柱制备、纯化融合蛋白;用Western blot对其进行鉴定;用FITC标记PTD-Sox2,与CHO细胞孵育,检测其穿膜能力;用FRET法检测转录因子Sox2结合目的DNA的活性.结果:构建了带有穿膜肽重组PTD-Sox2的原核表达菌,制备并纯化PTD-Sox2,对其活性鉴定.结论:PTD-Sox2能够穿过细胞膜与核膜,进入细胞核内,穿膜效率为40.86%,并且可与目的DNA进行特异结合,为蛋白体外诱导iPS的产生奠定基础.     

穿膜肽介导的新型基因转运载体的功能研究

目的：借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体（LacI HPM）高亲和力结合DNA的特性,建立-种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统。方法：在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建pET-28a（＋）-TAT-LacI HPM-GST和pGEX-GST-TAT-LacI HPM重组表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM-GST及GST-TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,获得TAT-LacI HPM二聚体,免疫荧光检测TAT-LacI HPM融合蛋白穿过HeLa细胞膜的情况,观察EGFP的表达,用免疫印迹检测TAT-LacI HPM融合蛋白介导质粒DNA进入细胞的能力。结果：表达、纯化并获得二聚体融合蛋白,体内实验表明其具有跨膜能力,能介导带有LacI结合序列的DNA质粒进入细胞,并在转染细胞里检测到了目的蛋白。结论：初步证实TAT-LacI HPM融合蛋白作为-种新型通用性非病毒DNA转运载体的可行性,为评价这种新型DNA疫苗载体在提高免疫效果方面的可行性奠定了前期实验基础。     

MSCs心肌样细胞分化过程中GCN5募集促分化相关蛋白的筛选

筛选并分析间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导分化为心肌样细胞过程中GCN5招募促分化相关蛋白集合体的组成。免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR鉴定MSCs经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)诱导分化为心肌样细胞;免疫共沉淀技术分离、串联质谱鉴定GCN5募集蛋白集合体组成,并从心肌细胞分化角度筛选、验证分化相关蛋白因子。MSCs经5-azaC诱导分化的心肌样细胞表达心肌特异性基因GATA4、MEF2C和心肌细胞结构、功能蛋白cTnt、MHC和Cx43;筛选、验证出心肌细胞分化相关GCN5招募蛋白归类为:(1)DNA结合蛋白Sp1/KLF;(2)转录辅激活子PGC-1α和Rb1;(3)转录延伸复合体组成成分以及信号通路蛋白Akt。通过筛选获得MSCs经诱导向心肌样细胞分化过程中心肌分化相关蛋白因子,为进一步研究干细胞分化信号传导途径、特异性生物靶点干预以及提高干细胞分化效率打下了基础。     

过表达KLF4重组质粒的构建及其在白血病K562细胞中的表达

为了构建过表达锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因的重组质粒pEGFP-KLF4,观察其在白血病K562细胞中的表达,以RT-PCR法扩增人KLF4基因,构建pEGFP-KLF4重组质粒;经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-KLF4质粒电穿孔转染白血病K562细胞(K562/pEGFP-KLF4组),设pEGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/pEGFP-C1组)及空白K562细胞作为对照,荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达情况,同时用抗生素G418筛选阳性克隆并扩大培养建立稳定过表达KLF4基因的K562细胞株,随后用RT-PCR检测3组K562细胞中KLF4的m RNA表达水平。实验结果显示,pEGFP-KLF4重组质粒构建成功。该质粒转染K562细胞24 h后能观察到较高强度的绿色荧光;经G418筛选出的阳性克隆扩大培养后建立了稳定过表达KLF4基因的K562细胞株;与对照组相比,K562/pEGFP-KLF4细胞组KLF4的m RNA表达水平明显升高,其过表达率为65.71%(P0.05)。实验中构建的过表达KLF4基因的重组质粒pEGFP-KLF4能在K562细胞中高效表达,为进一步研究其在白血病中的作用奠定了基础。     

SUMO-TAT-Klf4融合蛋白的原核表达及纯化

Klf4是体细胞诱导成多能干细胞的重要转录因子之一,参与细胞增殖分化。本研究通过将小鼠Klf4基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中进行表达,经PCR鉴定和酶切验证后,用IPTG诱导后表达出约78 k D的融合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析胶纯化获得了高质量的SUMO-TAT-Klf4蛋白,使用Western blotting检测显示特异性良好。本研究成功构建了pET3c-SUMO-TAT-Klf4原核表达载体,有利于获得大量的Klf4蛋白,并以期提高其穿透细胞膜的能力,为后续利用重编程因子融合蛋白诱导体细胞成为iPS细胞奠定基础。     

通过细胞穿膜肽和皂苷增强一种核糖体失活蛋白抗肿瘤活性

将核糖体失活蛋白类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1(BLF1)与细胞穿膜肽(CPP)HBP融合表达并与商陆皂苷甲(EsA)联合使用,提高BLF1重组蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性。通过原核表达及NI-NTA亲和层析纯化BLF1、BLF1-HBP融合蛋白,以HepG2、MCF-7、A549和HeLa细胞为检测模型,MTT法检测BLF1重组蛋白对肿瘤细胞的毒性,激光共聚焦显微镜观察重组蛋白进入细胞效率,流式细胞术分析抗肿瘤效应。结果显示,穿膜肽HBP可有效提高BLF1对HepG2、MCF-7、A549和HeLa四种肿瘤细胞的生长抑制作用,其中对HeLa细胞的药效增强效果最显著,可达47.5倍;皂苷EsA的使用进一步显著提高了BLF1-HBP对上述4种肿瘤细胞生长抑制活性,且对MCF-7细胞的IC50值从6 840 nmol/L降至0.57 nmol/L。激光共聚焦观察揭示EsA可有效促进BLF1重组蛋白进入肿瘤细胞效率,流式结果分析表明EsA可大大强化BLF1-HBP诱导肿瘤细胞凋亡的能力。将BLF1与穿膜肽HBP融合表达并在EsA存在下,可显著提升BLF1对肿瘤细胞的毒性,强化其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。     

带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .     

ZSCAN4在早期胚胎及多能干细胞中的作用及调节机制

含有锌指和SCAN结构域的蛋白质4 (zinc finger and SCAN domain containing 4, ZSCAN4)在2细胞期胚胎以及胚胎干细胞中作为DNA结合蛋白质特异性表达。ZSCAN4能够调控早期胚胎发育过程，在合子基因组激活(zygotic genome activation, ZGA)期间通过促进DNA损伤修复和纠正染色体异常，以维持植入前胚胎的基因组和染色体完整性。在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)向2细胞样细胞转换期间，ZSCAN4与ATP依赖性染色质重塑因子相互作用，调节鼠内源性逆转录病毒L(murine endogenous retrovirus L, MERVL)增强子的活性，激活周边的2细胞期基因的表达，促进胚胎干细胞向2细胞样细胞的转变。ZSCAN4还能通过降低DNA甲基化水平同时介导异染色质沉默，并促使端粒重组和端粒延伸，保持基因组稳定性，进一步维持多能干细胞的无限自我更新能力和多能性，促进mESCs向胚胎2细胞样细胞转变。此外，ZSCAN4还能在重编程中重新激活早期胚胎基因，显著提高诱导...     

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的 观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究.方法 构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率.结果 PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5 h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12 h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48 h达到最高凋亡效应.结论 PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础.     

TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化

利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET—TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS—clone3。融合蛋白在E．coli BL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18％;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。     

TAT-PTD融合蛋白可能存在的跨膜递送作用机制

为探讨TAT-PTD融合蛋白的跨膜递送作用机制,采用DNA重组技术构建pGEX-TAT-GFP-表达质粒.在E.coli- BL21表达GST-TAT-GFP,并用谷胱甘肽(glutathione) Sepharose-4B亲和柱进行纯化.GST-TAT-GFP在不同条件下与细胞的作用结果表明,GST-TAT-GFP能有效进入HeLa、SMMC-7721、L-02和BEL-7402细胞,GST-TAT-GFP在递送时对时间和浓度有依赖关系.同时,温度对GST-TAT-GFP跨膜作用具有明显的影响,GST-TAT-GFP的跨膜作用受代谢抑制剂的影响很小,肝素的存在能明显抑制GST-TAT-GFP跨膜进入细胞的能力,GST-TAT-GFP对细胞活性没有影响.这些结果说明,TAT-PTD可能是通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素等受体相结合介导融合蛋白跨膜递送进入细胞的.     

KLF4siRNA慢病毒载体构建和鉴定

目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。     

Kruppel样因子4对内毒素所致IL-6基因表达的调控及机制研究

探讨Kruppel样因子4(KLF4)对内毒素所致白介素(IL-6)的基因表达以及释放的影响,并对其调控机制做了初步研究．使用RT-PCR和Western blot检测KLF4 mRNA和蛋白质的表达．采用KLF4过表达的RAW264.7巨噬细胞株或反义寡核苷酸技术抑制内源性KLF4的表达,用RT-PCR和ELISA检测内毒素(LPS)刺激后IL-6 mRNA和蛋白质的表达．采用荧光素酶报告基因检测RAW264.7细胞中KLF4过表达对IL-6基因启动子报告基因转录活性的影响．使用EMSA法检测细胞中KLF4与IL-6基因启动子区KLF4元件的结合．结果表明：LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞KLF4的表达以及IL-6蛋白表达．KLF4过表达明显抑制IL-6的mRNA和蛋白质的表达,而KLF4缺失使这种作用消失．荧光素酶报告基因的结果显示,KLF4可以抑制LPS所致的IL-6基因启动子的转录活性．EMSA显示KLF4不能与IL-6启动子区的KLF4结合元件直接结合．结果表明,LPS可以促进RAW264.7小鼠巨噬细胞KLF4的表达和IL-6的释放．KLF4能抑制LPS诱导的IL-6表达和释放,其机制是抑制IL-6启动子的转录活性,但KLF4的抑制作用不是通过直接与IL-6基因的启动子区相结合而实现的．