人类TECTB基因的电子克隆

用小鼠和鸡的β-tectorin基因（Tectb)的编码区序列对NCBI数据库进行Blastn比较,得到一个相似性很高的人的gDNA序列（GenBank:AL157786),用GENSCAN、MZEF程序和Blast 2 sequence程序分析AL157786,推测AL157786中包含一个编码区由10个外显子构成的基因－TECTB基因。人TECTB基因的开放阅读框为990bp,推测编码329个氨基酸。人TECTB基因与小鼠的Tectb基因在900bp有88.1%的一致性,在329个氨基酸有94.2%的一致性。用Electronic-PCR将人TECTB基因定位于10q25。     

KLF4在内毒素血症小鼠中的表达模式及其意义

目的探讨Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4,KLF4）在内毒素血症小鼠中的表达模式及意义。方法运用实时荧光PCR技术和Western blot技术,分别从mRNA水平和蛋白水平探讨内毒素血症小鼠肝脏和肺脏中KLF4的表达;运用生物信息学技术,对启动子区含有KLF4的结合位点的炎症介质基因进行了预测;运用RT-PCR技术,从mRNA水平探讨内毒素血症小鼠肝脏和肺脏中IL1β的表达模式。结果内毒素血症小鼠肝脏和肺脏中KLF4 mRNA的表达下凋,KLF4蛋白的表达先下凋后升高;IL-18、IL-15、IL-12、IL-18、IL-10等炎症介质基因的启动子区均含有KLF4的结合元件,这些炎症基因的表达可能直接受到KLF4的调控;内毒素血症小鼠肝脏和肺脏中IL-IB的表达模式与KLF4的表达模式呈相反趋势。结论内毒素血症小鼠肝脏和肺脏中KLF4表达下调,KLF4在炎症介质基因表达调控中可能具有重要作用。     

热休克因子1通过上调蛋白质C减轻脓毒症凝血功能障碍保护小鼠急性肺损伤

目的 探讨热休克因子1 （HSF1）减轻脓毒症凝血功能障碍,保护小鼠急性肺损伤的机制。方法 本研究采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）制备脓毒症小鼠模型,检测凝血相关指标和观察小鼠肺部病理变化,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）、q RT-PCR和蛋白质印迹法（Western blot）等方法检测蛋白质C表达水平,通过质粒转染抑制或增强HSF1表达从而观察蛋白质C表达水平的变化,并利用生物信息学、凝胶电泳迁移实验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验探讨HSF1调节蛋白质C转录的机制。结果 在CLP脓毒症小鼠模型中,HSF-/-组小鼠的凝血活性与HSF1^+/+组相比明显增强,肺损伤明显加重。ELISA、qRT-PCR和Western blot检测发现,HSF^-/-脓毒症小鼠血浆和肺组织中的蛋白质C表达水平显著低于野生型小鼠。体外bEnd.3血管内皮细胞的实验结果显示,HSF1抑制脂多糖（LPS）诱导的蛋白质C表达,HSF1过表达则增强蛋白质C表达。生物信息学数据分析提示,蛋白质C启动子区含有HSF...     

Kruppel样因子4对内毒素所致IL-6基因表达的调控及机制研究

探讨Kruppel样因子4(KLF4)对内毒素所致白介素(IL-6)的基因表达以及释放的影响,并对其调控机制做了初步研究．使用RT-PCR和Western blot检测KLF4 mRNA和蛋白质的表达．采用KLF4过表达的RAW264.7巨噬细胞株或反义寡核苷酸技术抑制内源性KLF4的表达,用RT-PCR和ELISA检测内毒素(LPS)刺激后IL-6 mRNA和蛋白质的表达．采用荧光素酶报告基因检测RAW264.7细胞中KLF4过表达对IL-6基因启动子报告基因转录活性的影响．使用EMSA法检测细胞中KLF4与IL-6基因启动子区KLF4元件的结合．结果表明：LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞KLF4的表达以及IL-6蛋白表达．KLF4过表达明显抑制IL-6的mRNA和蛋白质的表达,而KLF4缺失使这种作用消失．荧光素酶报告基因的结果显示,KLF4可以抑制LPS所致的IL-6基因启动子的转录活性．EMSA显示KLF4不能与IL-6启动子区的KLF4结合元件直接结合．结果表明,LPS可以促进RAW264.7小鼠巨噬细胞KLF4的表达和IL-6的释放．KLF4能抑制LPS诱导的IL-6表达和释放,其机制是抑制IL-6启动子的转录活性,但KLF4的抑制作用不是通过直接与IL-6基因的启动子区相结合而实现的．     

一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1的克隆和特性分析

采用生物信息学方法和5′cDNA末端快速扩增法(RACE)技术相结合,克隆了一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1,并经RT-PCR测序及多组织膜RNA印迹证实.生物信息学分析显示,MIP-1定位于大鼠染色体1q12区,含5个外显子和4个内含子,开放阅读框(ORF)为1 827 bp,编码608个氨基酸,其编码蛋白N端含KRAB结构域,C端含14个连续的C2H2型锌指蛋白结构域,氨基酸第277位至293位为双向的核定位信号,多组织膜RNA印迹显示该基因在脑组织表达最高,其次是心脏,在其他组织表达较低或无表达.进一步深入研究该基因的功能具有重要生物学意义.     

热休克因子1对内毒素所致G-CSF基因表达的影响

为探讨热休克因子1(heatshockfactor 1,HSF1)活化和过表达对内毒素(endotoxin ,ET)所致粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulatingfactor,G CSF)基因表达的影响,采用大肠杆菌内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)处理RAW2 6 4 7巨噬细胞,并通过热休克预处理诱导HSF1活化,采用Western印迹检测HSP70的表达观察HSF1的活化情况,RT PCR检测热休克反应(heatshockresponse ,HSR)对G CSFmRNA表达的影响;构建HSF1的pcDNA3 1真核表达质粒,采用脂质体转染法建立HSF1过表达RAW 2 6 4 7巨噬细胞株,用免疫细胞化学和Western印迹观察HSF1的表达,RT- PCR及Northern印迹进一步研究HSF1对G CSF基因表达的可能影响.发现LPS诱导巨噬细胞中G- CSFmRNA表达增多,并随时间的延长,表达量逐渐增加;与单纯内毒素处理组相比,热休克预处理后,LPS诱导的巨噬细胞G- CSFmRNA的表达明显被抑制;建立的稳定表达HSF1的RAW 2 6 4 7细胞株中有HSF1蛋白的核移位;HSF1过表达可明显抑制LPS诱导的RAW2 6 4 7巨噬细胞G -CSFmRNA的表达.上述结果表明热休克预处理能抑制LPS诱导的巨噬细胞G- CSFmRNA的表达;HSF1过表达可抑制内毒素诱导的巨噬细胞G CSFmRNA的表达.     

核定位信号在热休克蛋白 70 抑制氧化应激所致 细胞核仁分离中的作用

为探讨核定位信号在热休克蛋白 70 (HSP70) 抑制 H²O² 所致核仁损伤中的作用,采用分子克隆技术分别构建了 4 个真核表达载体, pcDNA3.1(-)-HSP70^WT (HSP70 野生型), pcDNA3.1(-)-HSP70^ΔNLS (核定位信号缺失突变体 ), pEGFP-N1-HSP70^WT, pEGFP-N1- HSP70^ΔNLS. 向传代培养的 C²C¹²肌源细胞培养液中加入终浓度为 1.0 mmol/L 的 H²O² 模拟体外氧化应激 . 甲苯胺蓝染色细胞核仁发现,正常细胞仅有一个位于中央的、浓染致密的核仁颗粒 . 过氧化氢处理后 3 h ,可见明显的核仁分离 . 热休克反应处理的细胞及转 pcDNA3.1( － )-HSP70WT 细胞则能明显抑制氧化应激所致的核仁分离 . 荧光蛋白示踪及核仁蛋白质免疫印迹分析显示, H²O²处理后 1 h , HSP70WT 由正常时的细胞浆定位转为细胞核及核仁定位,而 HSP70ΔNLS 在 H²O²处理后仍定位于细胞浆,同时丧失了抑制核仁分离的作用 . 上述结果提示,野生型 HSP70 能显著抑制氧化应激所致细胞核仁分离,核定位信号通过介导 HSP70 向细胞核及核仁移位而决定 HSP70 对核仁损伤的保护作用 .