人工转录因子研究进展

转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子,通常由DNA结合结构域与效应结构域两部分组成,研究发现这两个结构域可以各自独立发生作用。基于转录因子的这种结构特点,可以人为地选择针对特定序列的DNA结合结构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子。目前人工转录因子的DNA结合结构域多为C₂H₂ 型锌指结构,每一个锌指单元由大约30个氨基酸组成,识别DNA双螺旋大沟中相连的3bp序列,并可通过氢键作用与相应的碱基结合;多个锌指可以串联成簇,从而识别并结合较长的DNA序列区域。常见的人工转录因子的效应结构域有激活结构域以及抑制结构域,不同的效应结构域赋予人工转录因子不同的功能。目前人工转录因子已经在基础研究、药物设计以及基因治疗等领域得到了广泛的应用。     

炭疽毒素保护性抗原的不同结构域对其表达可溶性的影响

目的：对炭疽毒素保护性抗原（PA）的不同结构域进行了缺失突变,以期找到免疫原性降低而功能变化不大的PA蛋白突变体。方法：在对PA结构域的缺失突变体进行表达时,意外发现不同的突变体表达效果之间存在很大差异,遂用DNAStar软件对PA的4个结构域和突变体进行分析。结果：PA蛋白结构域2的表面特性与其他结构域存在很大差异。结论：推断这种表面特性影响了PA突变体的可溶性特征。     

通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株

目的:对现有的CHO-DG44细胞株进行改造,得到在无血清培养基中更具生长优势的CHO宿主细胞株。方法:分别克隆转铁蛋白和细胞周期蛋白D1基因,构建共表达2种基因的pIRES质粒,转染CHO-DG44细胞株,筛选G418抗性克隆。结果与结论:得到3株G418阳性克隆株,其中转铁蛋白和细胞周期蛋白D1表达水平最高的S6与CHO-DG44相比,在无血清培养基中生长更快、密度更高。     

富含GC的DNA片段在哺乳动物细胞基因超高表达调控中的重要作用

通过在结构基因或基因启动子的5’和/或3’端加入天然1.006kb或人工合成0.733kb的富含GC的DNA片段(包括内含子),所构建的稳定表达载体在实验室规模实现了20多种蛋白质在哺乳动物细胞中超高表达.该实验提供了证据表明,非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)是一种超级"染色质开放元件",在哺乳动物细胞基因表达中起关键作用.实验还进一步表明,哺乳动物细胞的基因表达调控在染色质水平主要与DNA的一级结构,即DNA的GC含量有关.     

用Touch-Up PCR克隆中国仓鼠存活蛋白基因及其序列分析

目的:通过Touch-UpPCR(上升PCR)的方法从中国仓鼠卵巢细胞中克隆存活蛋白基因,并对其进行序列分析。方法:分别从293、H22、CHO-S细胞中提取总RNA并反转录得cDNA,然后用Touch-UpPCR克隆存活蛋白基因。结果:获得了存活蛋白基因,全长423bp,序列测定及同源性分析表明其与GenBank中报道的人以及小鼠的存活蛋白基因高度同源,同源性分别为84.8%和88.2%;氨基酸序列分析表明它们的蛋白产物具有功能相同的BIR结构域。结论:从中国仓鼠卵巢细胞中首次克隆到存活蛋白基因。     

Sos恢复系统--一种新型的酵母双杂交系统

Sos恢复系统是一种新型的不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统,原理是通过蛋白质的相互作用将Sos富集在细胞膜上激活Ras信号通路,使得酵母温度敏感缺陷株可以在限制温度下生长。与传统的酵母双杂交系统相比,Sos恢复系统的主要优点在于被研究的蛋白质的相互作用发生在胞质而不是核中;而且,它更适合研究转录因子以及在胞质中行使生理功能的蛋白质。Sos恢复系统克服了传统的酵母双杂交系统的一些限制,大大拓展了酵母双杂交技术的应用范围。     

一种特异识别SV40启动子的人工转录因子的构建

转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子,通常由DNA结合域与效应域两部分组成,而锌指结构是DNA结合域的常见组成单元。人工转录因子就是基于转录因子的这种结构特点,人为地选择针对特定序列的DNA结合域与具有特定作用的效应域组合而成。利用噬菌体展示技术,筛选到与SV40启动子上9bp序列特异结合的锌指结构,再连接KOX1的KRAB域构建了一种人工转录因子。转染实验表明它对SV40下游的报告基因的表达有很显著的抑制作用。     

TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化

利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET—TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS—clone3。融合蛋白在E．coli BL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18％;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。     

特异识别HIV-1序列的锌指蛋白的表达纯化及其在Biacore CM-5芯片上的固定

目的:为了更好地利用Biacore 3000研究锌指与核酸的相互作用,将特异性识别HIV-15′端一段保守序列的三锌指蛋白固定在CM-5芯片上。方法:将特异性识别HIV-15′端一段保守序列5′-CTGTGTTTG-3′的三锌指基因克隆到表达载体pET-22b( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组三锌指蛋白,超声碎菌进行SDS-PAGE分析;包涵体形式的表达产物用盐酸胍溶解后,经一步凝胶柱复性并纯化;随后摸索适宜固定的pH值并通过化学方法进行固定。结果:表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化及柱复性后的蛋白纯度为98.8%,并在CM-5芯片上成功固定。结论:本研究为利用Biacore实时定量研究锌指蛋白与其识别DNA的相互作用进行了尝试。     

中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造

哺乳动物细胞因其表达的外源蛋白最接近天然构象,已成为生产重组蛋白药物的理想系统。其中,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前最为常用的表达系统,但这种系统也存在很多缺点,如大规模培养中表达量低、生产成本高、细胞无限度增殖及细胞凋亡等。目前,通过优化培养基配方和培养条件很难从根本上解决上述问题,必须从整个表达系统着手进行改造,其中CHO细胞本身和表达载体的改造最为关键。