通过细胞穿膜肽和皂苷增强一种核糖体失活蛋白抗肿瘤活性

将核糖体失活蛋白类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1(BLF1)与细胞穿膜肽(CPP)HBP融合表达并与商陆皂苷甲(EsA)联合使用,提高BLF1重组蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性。通过原核表达及NI-NTA亲和层析纯化BLF1、BLF1-HBP融合蛋白,以HepG2、MCF-7、A549和HeLa细胞为检测模型,MTT法检测BLF1重组蛋白对肿瘤细胞的毒性,激光共聚焦显微镜观察重组蛋白进入细胞效率,流式细胞术分析抗肿瘤效应。结果显示,穿膜肽HBP可有效提高BLF1对HepG2、MCF-7、A549和HeLa四种肿瘤细胞的生长抑制作用,其中对HeLa细胞的药效增强效果最显著,可达47.5倍;皂苷EsA的使用进一步显著提高了BLF1-HBP对上述4种肿瘤细胞生长抑制活性,且对MCF-7细胞的IC50值从6 840 nmol/L降至0.57 nmol/L。激光共聚焦观察揭示EsA可有效促进BLF1重组蛋白进入肿瘤细胞效率,流式结果分析表明EsA可大大强化BLF1-HBP诱导肿瘤细胞凋亡的能力。将BLF1与穿膜肽HBP融合表达并在EsA存在下,可显著提升BLF1对肿瘤细胞的毒性,强化其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。     

EGF类生长因子来源的新型靶向肽在抗肿瘤药物蛋白中的应用

许多肿瘤细胞表面表皮生长因子受体EGFR都存在过表达现象。考察了牛痘病毒生长因子(VGF)中的EGFR结合域(S3)与人的肝素样表皮生长因子(HB-EGF)来源的肝素结合域(命名为HE)重组后对肿瘤细胞的选择性。通过重组表达带有靶向和穿膜结构域的EGFP-S3-HE和EGFP-S3-HE-TATm两种融合蛋白与正常细胞和肿瘤细胞的共孵育实验来研究其对肿瘤细胞的特异性靶向吸附和穿膜效应。进一步将S3-HE-TATm靶向穿膜序列与苦瓜来源的核糖体失活蛋白MAP30融合,可显著提高MAP30对肿瘤细胞的抑杀作用,但这种抑杀作用却对正常细胞仍保持在较低水平。由此表明S3-HE-TATm是一种新型优异的肿瘤细胞靶向药物运输载体,可用于肿瘤治疗的进一步开发研究。     

重组黄杆菌肝素酶III的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响

肝素酶III是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。为实现肝素酶III的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶III融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseIII,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达。粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上。通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机、诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶III融合蛋白的最适生产条件。通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca2+浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件。     

一种用于药物蛋白亲和纯化和跨膜转运的双功能标签的开发

目的:开发一种既能用于亲和纯化目标蛋白,又可介导不能自主进入细胞的药物蛋白跨膜转运到细胞内发挥活性的双功能标签。方法:从已有文献资料中挑选四种富含碱性氨基酸的钙调蛋白结合肽(calmodulin binding peptide,CBP),将其与绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达,然后采用与钙调蛋白(calmodulin,CaM)亲和结合过程来筛选与CaM具有最高亲和力的CBP;随后采用荧光显微镜检测、激光共聚焦显微镜检测以及流式细胞术等技术来分析测定和比较候选CBP序列将EGFP重组蛋白自主转运进入细胞的能力。最后将筛选到的新型CBP双功能标签与凋亡蛋白融合表达,考察其与CaM亲和结合后纯化重组凋亡蛋白的能力,以MTT法分析此重组蛋白进入肿瘤细胞抑制生长的能力。结果:通过CaM-CBP亲和层析筛选出与CaM具高有亲和力的三种CBP序列;从重组蛋白胞内荧光检测结果得知,带有野生型骨骼肌肌球蛋白轻链激酶CBP序列(MLCK)的重组EGFP蛋白具有最佳跨膜转运效率,且显著高于来源于艾滋病毒的经典穿膜肽TAT的穿膜效率。以此MLCK新型双功能标签成功地通过CaM-CBP亲和结合纯化得到重组凋亡蛋白,并可将重组凋亡蛋白转运进入细胞内发挥抗肿瘤作用。重组凋亡蛋白对MGC-803、H460、HeLa三种肿瘤细胞生长的24h半抑制浓度(IC50)分别为:1. 18μmol/L、1. 23μmol/L、1. 23μmol/L。结论:筛选得到一种新型双功能标签MLCK,其可通过与CaM高亲和作用进行亲和纯化;同时标签本身还具有和典型穿膜肽一样的高效跨膜转运功能,可将药物蛋白自主转运进入细胞,发挥药物的生物活性。因此,新型双功能标签既可用于药物蛋白的亲和纯化,又兼具体内跨膜运输作用,可广泛用于各种新型药物的开发。     

商陆皂苷甲的联用可显著提高tApoptin凋亡蛋白的抗肿瘤活性

凋亡蛋白（apoptin）因可特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡而备受广大研究人员的关注。但由于凋亡蛋白质本身结构特性等方面的原因,导致通过原核表达的蛋白质不稳定,很容易聚集沉淀,并且凋亡蛋白质本身也不能自主跨膜进入胞内发挥其生物学作用。本文考察了一种野生型凋亡蛋白N-末端缺失突变体tApoptin（1～43氨基酸残基缺失）在大肠杆菌中以可溶性形式表达,并且通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察到,这种N-端缺失突变体tApoptin与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）的融合蛋白质具有自主进入A549、HeLa、H460和SK-OV-3等多种肿瘤细胞的能力,而且这种转运效率具有细胞特异性。与肝素钠共孵育可抑制tApoptin进入细胞的能力,推测tApoptin可能是通过与细胞表面硫酸乙酰肝素多糖结合后被内吞进入细胞。MTT的结果显示,突变体tApoptin依然保持了全长凋亡蛋白质的抗肿瘤特性,对所测试的多种肿瘤细胞生长都具有不同程度的抑制作用。与tApoptin给药组相比,tApoptin与传统中药材来源的商陆皂苷甲（esculentoside, EsA）联用的给药组,对测试的4种肿瘤细胞的药效提升约100倍以上。其中,对SK-OV-3细胞的提升效果最显著,提升463倍,半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）从27.37 ± 2.25 μmol/L 降低到 0.059 ± 0.003 μmol /L。流式细胞术分析表明,与tApoptin给药组相比,tApoptin与EsA联合的给药组细胞凋亡率显著增加（6.46 ± 0.34% vs. 41.9 ± 0.47%, P<0.001）。与溶酶体共定位的共聚焦结果表明,EsA可能通过破坏细胞中的溶酶体促使tApoptin释放到胞质内有效发挥其药理作用。     

一种用于肿瘤药物治疗的新型人源性穿膜肽的优化及其应用

细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide,CPP)作为一种体内大分子药物跨膜运输载体被广泛研究和应用。中期因子Midkine(MK)是人体的一种带有肝素结合域(heparin-binding domain,HBD)的生长因子。报道了MK中HBD的部分富含碱性氨基酸的基因序列(命名为MK-S0)与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合表达后,能将EGFP有效地转运入胞内,且其穿膜转运效率高于经典穿膜肽Tat。将MK-S0序列进一步突变优化改造得到的midkine-mutantΔ4(MK-Δ4),其穿膜效率比天然序列来源的MK-S0提高16倍以上,且MK-Δ4的穿膜转运作用适用于多种肿瘤细胞。穿膜机制分析研究结果显示,MK-Δ4可与细胞表面硫酸乙酰肝素结合,随之以巨胞饮形式内吞入胞。采用MTT方法检测的细胞生长抑制试验结果显示,连接有MK-Δ4的苦瓜来源的核糖体失活蛋白MAP30比单独的MAP30对HeLa肿瘤细胞的药效可提升5.8倍,大大提高了这种药物蛋白抑杀肿瘤细胞的效果。由此表明,源于MK的这种经过突变改造的MK-Δ4,可作为一种新型高效的细胞穿膜肽,将药物蛋白有效运输到细胞内发挥抗肿瘤效应。     

坦洛新联合托特罗定对老年膀胱过度活动综合症患者P2X3受体表达的影响

目的:探讨坦洛新联合托特罗定对老年膀胱过度活动综合症患者P2X3受体表达的影响。方法:收集我院收治的膀胱过度活动综合症患者60例,随机分为对照组和实验组,每组各30例,对照组患者给予盐酸坦洛新缓释胶囊,实验组患者在对照组的基础上给予酒石酸托特罗定。观察并比较所有患者的最大尿流速率、膀胱残余尿量、排尿次数、单次最大尿量水平以及患者的治疗效果。结果:治疗后,两组患者治疗后单次最大尿量、最大尿流速率均升高(P0.05),膀胱残余尿量、排尿次数以及P2X3水平均降低(P0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后单次最大尿量、最大尿流速率较高(P0.05),膀胱残余尿量、排尿次数以及P2X3水平较低(P0.05);实验组患者临床总有效率与对照组相比较高(P0.05)。结论:坦洛新联合托特罗定能够显著提高老年膀胱活动度综合征患者临床疗效,可能与其降低患者血清P2X3受体水平有关。     

重组黄杆菌肝素酶Ⅲ的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响

肝素酶Ⅲ是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体.为实现肝素酶Ⅲ的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶Ⅲ融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseⅢ,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达.粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上.通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机,诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶Ⅲ融合蛋白的最适生产条件.通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca~(2+)浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件.     

小鼠胶源神经营养因子基因的克隆及其性质研究

本文从成年小鼠脑基因库中克隆了两种独特的胶源神经营养因子转录产物。ＧＤＮＦ－β除了在开放阅读框架区有７８ｂｐ的缺失外,其余与ＧＤＮＦ－α相同。由小鼠ＧＤＮＦ－α基因推导得的氨基酸顺序与大鼠和人的氨基酸顺序具有高度同源性。对小鼠不同组织的反转录ＰＣＲ实验表明在这些组织中广泛存在这两种形式的ＧＤＮＦ。     

人脐血干细胞对兔后肢动脉球囊损伤后内膜增殖和内皮功能的影响

目的探讨人脐血干细胞(HUCBSC)移植对兔后肢动脉球囊损伤后动脉局部内膜增殖和内皮功能的影响。方法新西兰大白兔24只,随机分为正常对照组(A组,8只)、球囊损伤组(B组,8只)及球囊损伤加干细胞移植组(C组,8只)。三组均于全麻下分离兔右侧股动脉;B、C两组均应用3 mm×40 mm球囊扩张股动脉,每次3 min,共3次,并牵拉球囊,形成局部内膜损伤;C组球囊扩张后,以2.5×105的HUCBSC数移植到损伤血管局部,A、B组注入等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。术前和术后28 d采用放射免疫法和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别测定血浆内皮素-1(ET-1)及血清一氧化氮(NO)水平,并取股动脉采用苏木素-伊红染色(H-E)测定血管内膜面积及内膜面积与中膜面积比值。采用方差分析和配对t检验进行统计分析。结果术后28 d,B组和C组均可见损伤血管内弹力膜多处断裂,有不同程度的内膜增生,C组内膜面积[(0.231±0.033)mm2]及内膜面积与中膜面积比值(0.967±0.193)明显低于B组[(0.589±0.038)mm2,2.365±0.376;t=19.632,P<0.01,t=9.405,P<0.01],但明显高于A组(正常对照组)。术后28 d,A、B、C三组静脉血浆ET-1水平分别为(79.91±7.36)ng/L,(131.51±12.88)ng/L,(103.98±11.13)ng/L,B组明显高于A组(t=8.014,P<0.01),C组也明显高于A组(t=4.329,P<0.01),但明显低于B组(t=4.634,P<0.01)。静脉血清NO水平分别为(120.33±9.02)μmol/L,(48.01±6.20)μmol/L,(102.76±9.73)μmol/L,B组明显低于A组(t=18.914,P<0.01),C组也明显低于A组(t=3.901,P<0.01),但明显高于B组(t=14.083,P<0.01)。结论 HUCBSC血管局部移植可抑制兔后肢动脉球囊损伤后受损血管新生内膜的增殖,促进损伤血管内皮功能的恢复。