删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高 (R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

随机-半理性组合突变改造ω-转氨酶催化合成(R)-1-(1-萘基)乙胺

(R)-1-(1-萘基)乙胺是合成拟钙剂药物盐酸西那卡塞的关键手性中间体,利用ω-转氨酶不对称还原1-萘乙酮合成(R)-1-(1-萘基)乙胺具有较好的应用前景。文中针对节杆菌属Arthrobacter sp.来源的ω-转氨酶,采用随机突变和半理性设计相结合的策略,获得了催化效率和热稳定性提高的突变酶F225M、C281I和F225M/C281I。与WT相比,双突变体F225M/C281I的kcat提高85%,Km下降56%,催化效率kcat/Km提高3.42倍。此外,F225M/C281I催化10mmol/L1-萘乙酮反应24h的转化率提高了22%。分子对接和分子动力学模拟结果表明,F225M/C281I相比于WT增加了与底物1-萘乙酮之间的Pi-Pi相互作用力,导致其催化效率的提高;而且突变酶F225M/C281I的134–139位点残基的均方根波动(RMSF)相比WT明显降低,与半衰期的略微提高相关。     

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。     

通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性

应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。     

技术与方法理性设计改造牛肠激酶的热稳定性

以牛肠激酶作为研究对象,利用理性设计的方法提高其热稳定性。首先通过分子动力学模拟软件Gromacs v 4.5.5,FlexService以及B-FITTER软件预测出了肠激酶的柔性区Fragment 64～69,Fragment 85～90;然后结合β-转角序列统计学信息以及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则,确立了3个突变位点S67P,R87P以及Y136P;通过Quik Change^TM 定点突变的方法引入突变位点,并进行了酶热稳定性分析。结果表明,R87P突变体酶的失活半衰（t_1/2）和T₅₀¹⁰ 较野生型分别提高了3.1 min和11.8℃,同时,动力学常数（K_m/k_cat）测定结果显示酶活未受到显著影响。该策略有潜力应用于其他工业酶分子的热稳定性改造,为推动生物酶的工业化应用奠定基础。     

利用脯氨酸效应提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的热稳定性

以磷酸吡哆醛为辅酶的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。为了提高GAD热稳定性为目标,本研究通过与嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis中GAD氨基酸序列的比对及引入脯氨酸策略,最终在短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC No.1306的GAD突变体中筛选得到热稳定性提高的突变酶G364P。结果显示,突变酶G364P在55℃的半衰期以及半失活温度分别比野生酶提高19.4 min和5.3℃,并且突变酶G364P的催化效率与野生酶相比没有明显变化。此外,利用分子动力学模拟来验证突变对蛋白质热稳定性的影响,突变酶G364P的均方根偏差(Rootmeansquare deviation,RMSD)以及含G364的loop区域均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)均比野生酶低,引入脯氨酸增加了364位氨基酸与相邻氨基酸的疏水相互作用。文中通过引入脯氨酸成功提高了L. brevis中GAD的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

定点突变提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性

嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比原始酶(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比原始酶(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示原始酶和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的T_m值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃和54.8℃。蛋白三维结构模拟推测突变体热稳定性提高机理为:突变体K94R中Arg94与Ile95之间形成额外氢键,稳定其所在的柔性区域;突变体G221A中Ala221与Leu281产生疏水作用,稳定酶分子C-端柔性区。该研究结果为蛋白质热稳定性改造提供了参考,也为苯丙氨酸羟化酶在功能性食品领域的应用奠定了基础。     

嗜热毁丝菌外切葡聚糖苷酶CBH1环状结构对酶活性及热稳定性的影响

糖苷水解酶第七家族(GH7)的外切葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase),又称为纤维素生物降解酶(CBHs),在其催化中心活性通道的顶端有1个环状结构,嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)第七家族外切葡聚糖苷酶CBH1的环状结构(LS,Loop Structure)由9个氨基酸组成,即G245-Y253,但其对酶特性影响机制尚不清楚。本文构建环状结构缺失突变体CBH1-DM﹝Δ(G245-Y253)﹞以研究该结构对酶特性的影响。野生酶WT与突变酶CBH1-DM通过毕赤酵母表达并纯化,将纯化产物进行酶学性质的测定及分析。研究结果显示野生酶和突变酶的最适反应温度和最适p H值均相同,分别为50℃和5.0。CBH1-DM的比活力为2.42 U/mg,是WT(1.17 U/mg)的2.1倍。野生酶与突变酶在70℃处理1 h后,野生酶仅剩余35%的酶活力,而突变酶剩余70%的酶活力,具有较好的热稳定性。研究表明环状结构对酶的活性及热稳定性具有显著影响。     

枯草杆菌蛋白酶E的蛋白质工程

用定点突变和随机突变的方法,对枯草杆菌碱性蛋白酶E基因进行改造。突变后的基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBE-2中,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DBl04中进行表达,得到突变种的碱性蛋白酶．它们的突变位点分别是(M222A)、(M222A、N118S)、(M222A、N118S、Q103R)、(M222A、N118S、Q103R、D60N)。各突变种酶的性质测定 结果表明．M222A突变使酶抗氧化,N118S突变使酶增加热稳定性,Q103R和D60N突变虽然能增加酶的比活,但使酶的热稳定性大大下降,尤其是D60N突变使酶变得极不稳定。野生型碱性蛋白酶与(M222A)突变种的等电点均为8．92．而M222A,N118S)。(M222A,N118S ,Ql03R)和(M222A,118S．Q103R,D60N)突变酶分别为8.88．9.10和9．17。用Nsuc-AAPF-pNA作为底物时酶反应景适pH值为7.5～9.5,而用酪蛋白底物时最适pH值为10～12。     

应用拉氏图信息提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化性能

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。     

S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。     

米根霉α-淀粉酶热稳定性的理性设计

真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业,但其热稳定性普遍较差,在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上,为提高米根霉α-淀粉酶(ROAmy)的热稳定性,基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟,利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明,所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性,其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P,其在55℃下的热失活半衰期(t_(1/2))约为原酶的5.63倍。同时,该突变体的最适温度由50℃提高到了65℃,最大反应速率(V_(max))和催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析,发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

黄翅大白蚁来源β-葡萄糖苷酶的分子改造

纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的K_(cat)/K_m值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率。     

基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。     

大肠杆菌转酮醇酶分子改造及催化酒石酸半醛合成

转酮醇酶(transketolase,TK,EC. 2.2.1.1)是一种焦磷酸硫胺素和二价阳离子依赖性酶,可催化二碳单位的转移,可逆形成C–C键,在多酶催化生产化学品、药物前体和不对称合成方面有广泛应用。文中以大肠杆菌(Escherichia coli)K12转酮醇酶TKTA为研究对象,通过定点饱和突变和组合突变提升对非磷酸化底物的反应活性,并探索突变酶TKTA_M催化合成酒石酸半醛。结果表明：突变酶TKTA_M(R358I/H461S/R520Q)最适反应温度为32℃,最适反应pH为7.0,以d-甘油醛为受体底物的比酶活为(6.57±0.14)U/mg,是野生型比酶活((0.71±0.02)U/mg)的9.25倍。在酶学性质研究的基础上,设计20mL的反应体系,以50mmol/L5-酮基-d-葡萄糖酸和50mmol/L非磷酸化乙醇醛为底物,TKTA_M催化合成酒石酸半醛,最终酒石酸半醛的产量为3.71g,摩尔转化率为55.34%。研究结果为生物质制备l-(+)-酒石酸提供数据支撑,同时为转酮醇酶催化非磷酸化底物提供了借鉴。     

Met196突变提高Brucella melitensis 7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性

【目的】通过计算机辅助设计,理性提高羊布鲁氏菌7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性,实现酶的高效稳定催化合成。【方法】通过同源建模、分子对接和蛋白-配体相互作用分析,理性设计关键位点的定向突变。结合酶学性质测定、酶促反应动力学分析和圆二色谱测定等实验,测定突变酶的催化功能和稳定性。【结果】与野生型7α-羟基类固醇脱氢酶相比,Met196Ile和Met196Val突变酶的酶活提高了8.33倍和7.41倍,k_cat/K_m值分别提高了4.93和4.37倍,T_m值分别提高了1.75℃和1.10℃。Met196Ile和Met196Val突变酶催化底物鹅去氧胆酸,合成产物7-氧代-石胆酸所需时间从野生型的8h缩短为2h,最高产率约为91%。通过全原子动力学模拟分析了均方根偏差、均方根波动以及蛋白-配体相互作用,阐明了催化性能提高的分子机制。Met196突变诱导的B环（残基Ala145-Pro157）和α7螺旋（残基Val249-Gly265）的刚性增强有利于提高蛋白的稳定性,底物与结合位点或活性位点（Tyr208、Lys212）...     

α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。     

人类线粒体肌酸激酶uMtCK的底物结合位点分析

研究人类线粒体肌酸激酶u Mt CK的结合位点,将其与底物肌酸和ATP结合有关的关键氨基酸进行突变,并对突变体进行酶动力学和圆二色谱数据分析,探讨这些关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用。结果显示,与野生酶相比,突变体Q313A和R336A的K_m~(Cr)分别提高了2.6和2.9倍,k_(cat)下降了19%和55%;同样地,与ATP结合相关的突变体R125A和R287A分别使得K_m~(ATP)升高了3.2和4.2,k_(cat)下降了72%和38%。以上结果表明突变体R125A、R287A、Q313A和R336A影响对底物的结合,同时也降低了酶促反应的速度。利用圆二色谱比较野生酶与不同突变体的二级结构并无明显变化,但进一步的结构模拟表明底物结合位点氨基酸在与底物之间的氢键对底物的识别和酶催化过程中发挥着重要作用。     

生理pH条件下精氨酸脱亚胺酶的分子改造研究

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI）因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注. 目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临床研究阶段. 作为药用酶,当前报道的ADI在体内生理条件下普遍存在酶活低、半衰期短、底物亲和性弱等局限性.本研究结合随机突变及基于理性设计的定点突变两种方法,对研究室前期自主筛选得到的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida来源的ADI经一轮定向进化后所获优势突变株M314(A128T/H404R/I410L)进行分子改造.通过对随机突变法获得的1480个突变株进行96孔板高通量筛选,得到优良突变株M173(A128T/H404R/I410L/K272R);同时,基于同源序列比对及ADI蛋白三维结构同源建模,采用PyMOL软件理性预测和分析其活性中心及附近保守区域氨基酸位点对蛋白功能的影响,选择了6个位点D78E、L223I、P230I、S245D、A275N、R400M分别在M314的基础上进行定点突变,最终获得优势突变株M04(A128T/H404R/I410L/S245D). 通过对突变株的酶学性质以及动力学参数分析发现：生理pH值下,突变株M173的酶比活（12.32 U/mg）在M314（9.02 U/mg）的基础上提升3659%,Kcat/Km提高5236%;而突变株M04的最适pH由6.5升高至7.0,更接近体内生理pH,其比酶活（14.66 U/mg）较M314提升62.53 %,Kcat/Km提高了37.12%. 综上结果,本研究结合两种分子改造方法成功地对该ADI在生理pH条件下的酶活和酶学性质进行了改良,并为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据.