基于分子动力学模拟的高γ-环糊精专一性环糊精糖基转移酶理性改造

【背景】环糊精糖基转移酶的分子动力学模拟较传统基因改造而言能有效提高改造效率,减少盲目性。【目的】探究环糊精糖基转移酶的催化专一性机理,为获得产γ-环糊精专一性更高的环糊精糖基转移酶提供高效突变菌株方法。【方法】通过分子对接和分子动力学模拟,获得3种产物类型CGTase与底物的对接模拟结构,并通过定点突变实验进行验证。【结果】分子动力学模拟结果显示α-和β-CGTase与十糖链在酶蛋白S1区域呈现闭合的形态,而γ-CGTase和十糖链在S1区域呈现更易于生成γ-环糊精的张开形态;3种CGTase与十糖链在相同位置存在氢键的氨基酸共有17个相对应位点,其中14个位点的氨基酸种类一致,不一致的3个氨基酸对应α-CGTase位点分别为Y89、D234和Y262。本研究对Y262位点进行定点突变和产物专一性实验,结果显示经过分子动力学预测的Y262L有助于提高产γ-CD专一性,从野生酶的13.7%提高到39.9%,γ-环糊精产物比例提高了3倍。【结论】分子动力学模拟结果对于指导环糊精糖基转移酶的专一性内在机理具有一定的正向指导意义。     

亚位点?7处突变对碱性芽胞杆菌CGT酶产物特异性的影响

为了研究来源于碱性芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)具有较高产物特异性的作用机理,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其亚位点7处氨基酸的缺失可能影响其产物特异性。运用重叠PCR的方法,在其亚位点7处添加缺失的6个氨基酸,造成插入突变。将突变基因与pET-20b(+)连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以可溶性淀粉为底物进行酶转化,HPLC分析转化产物中的环糊精含量。结果表明,相对于野生型γ-CGT酶,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0%降至12.5%,α-、β-环糊精分别从8.7%和15.2%提高至37.5%和50%。分析其可能机理为:与α-、β-CGT酶相比,野生型γ-CGT酶的亚位点7处缺失6个氨基酸,该构象为葡萄糖的结合提供了更大的空间,从而更适合γ-环糊精的生成;而在其亚位点7处插入6个氨基酸,造成插入突变后,葡萄糖链结合的空间变小,这种构象不利于γ-环糊精的生成。     

Bacillus clarkii 7364 γ-环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达及其催化特性分析

按照大肠杆菌偏爱密码子对Bacillus clarkii 7364来源的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)进行优化,构建γ-CGTase原核表达菌株,摸索γ-CGTase的可溶性表达条件及纯化条件,并对其催化特性进行研究。结果表明:在28℃条件下实现了γ-CGTase的高效可溶性表达,可溶性蛋白占总蛋白表达量的63%,酶活可达3 830 U/mL。经(NH4)2SO4沉淀和α-CD-Sepharose 6B亲和柱纯化后,酶蛋白纯化了12.97倍,酶收率20.31%。使用该酶对木薯淀粉进行转化,转化产物中γ-环糊精(γ-CD)的比例可达90.9%,几乎无α-环糊精(α-CD),与天然酶的79%相比提高了15%。将该基因工程菌在20 L发酵罐中发酵,10 h后酶活达到4 375 U/mL,证实了其工业化放大的可能。该酶具有非常高的转化专一性,有非常好的工业化前景。     

信号肽对浸麻类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外表达的影响

为了筛选得到利于浸麻类芽孢杆菌Paenibacillus macerans α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)分泌表达的信号肽,提高α-CGT酶的分泌表达量,本研究考察了大肠杆菌中外源蛋白分泌表达常用的OmpA、PelB、OmpT和Endoxylanase四个信号肽对重组α-CGT酶在大肠杆菌中胞外表达的影响.在...     

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602 -1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(ot-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E coli M15后,得到重组菌株E coli M15 (PQE30/cgt).在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌.酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果.通过SDSPAGE验证了上述结论.酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1％可溶淀粉24h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2％,α和β的峰面积比约为3.4:1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景.     

应用拉氏图信息提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化性能

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。     

简单节杆菌3-甾酮-△1 -脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究

目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。     

Met196突变提高Brucella melitensis 7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性

【目的】通过计算机辅助设计,理性提高羊布鲁氏菌7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性,实现酶的高效稳定催化合成。【方法】通过同源建模、分子对接和蛋白-配体相互作用分析,理性设计关键位点的定向突变。结合酶学性质测定、酶促反应动力学分析和圆二色谱测定等实验,测定突变酶的催化功能和稳定性。【结果】与野生型7α-羟基类固醇脱氢酶相比,Met196Ile和Met196Val突变酶的酶活提高了8.33倍和7.41倍,k_cat/K_m值分别提高了4.93和4.37倍,T_m值分别提高了1.75℃和1.10℃。Met196Ile和Met196Val突变酶催化底物鹅去氧胆酸,合成产物7-氧代-石胆酸所需时间从野生型的8h缩短为2h,最高产率约为91%。通过全原子动力学模拟分析了均方根偏差、均方根波动以及蛋白-配体相互作用,阐明了催化性能提高的分子机制。Met196突变诱导的B环（残基Ala145-Pro157）和α7螺旋（残基Val249-Gly265）的刚性增强有利于提高蛋白的稳定性,底物与结合位点或活性位点（Tyr208、Lys212）...     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

非解朊栖热菌HG102耐热β-糖苷酶的结构与功能研究

非解朊栖热菌HG10 2耐热 β-糖苷酶为 (β/α)₈桶状结构 ,是具有水解功能和转糖苷功能的单体酶。该酶可以作为一个很好的模型来研究糖苷酶的反应机制、底物特异性和耐热的分子基础。根据对该酶的晶体结构解析和同家族酶的结构比较 ,推测Glu164和Glu338分别是质子供体和亲核基团两个活性位点 ;在α-螺旋N端第一位的脯氨酸和蛋白质外周的精氨酸是耐热机制的关键位点和关键氨基酸残基。为确定这些氨基酸残基的功能 ,通过基因定点突变的方法分别把Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344和Arg325置换成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu ,同时还对Pro316和Pro356进行了双置换。突变酶经过纯化得到电泳纯 ,用CD光谱进行了野生酶和突变酶的结构比较。通过突变酶的酶功能和酶学性质分析 ,结果表明Glu164和Glu338分别是质子供体和亲核基团 ,亲核基团的突变酶TnglyE338A可以合成混合型糖苷键寡糖类似物 ;在α-螺旋N端第一位的Pro316和Pro356以及在蛋白质外周形成离子键的Arg325均是对耐热性有贡献的关键氨基酸残基。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

化学添加剂提高重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性

通过向重组α-环糊精葡萄糖基转移酶 (α-CGT酶) 液中添加化学添加剂以提高其热稳定性及贮存稳定性。在不同温度下研究了添加剂对酶液的贮存稳定性影响,并用圆二色谱 (CD) 研究了CGT酶在近紫外区和远紫外区蛋白质结构与热稳定性的变化关系。当单独加入各种添加剂在50 ℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20％甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91％和50％的酶活,对照酶液在50 ℃水浴1 h后仅有小于10％的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaCl2和PEG40     

定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力

应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶(PtLic16A)在酸性条件下的催化能力.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了β-葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系.筛选得到的突变酶PtLic 16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活.突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G.结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用.     

环糊精葡萄糖基转移酶钙离子结合位点结构与功能分析

通过多重序列比对和晶体结构分析发现,钙离子结合位点CaⅠ和CaⅡ普遍存在于环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)中,且两个位点处氨基酸残基具有较高的保守性,而钙离子结合位点CaⅢ仅存在于少数CGT酶中．此外,研究发现,钙离子结合位点可能与CGT酶的环化活力、热稳定性和产物特异性密切相关．     

异淀粉酶在α-环糊精制备中的应用及条件优化

环糊精具有外侧亲水内部空腔疏水的桶形结构,可与众多的各类大小、形状合适的疏水性客体分子形成包合物,改变其理化性质。其中,α-环糊精(α-CD)具有较小的空腔、溶解性好及耐酸解,因此在很多领域具有特殊的应用。目前,单独采用环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)生产α-CD的底物利用率低,而已开发的双酶法不仅底物成本高,而且环糊精总转化率及α-CD比例也有待提高。因此,为了提高α-CD的得率,降低生产成本,本研究将α-CGTase与异淀粉酶复配,以木薯淀粉为底物,对酶转化条件进行了优化。结果表明,当底物浓度15%,液化时间10 min,温度40℃,反应p H 5.5,异淀粉酶加量144 U/g底物,α-CGTase加量15 U/g底物,正癸醇浓度5%(v/v),转化周期18 h,环糊精总转化率为90.5%,α-CD所占比例为96.3%,α-CD的转化率为国内外报道的最高水平。     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

表面活性剂对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响

研究了不同浓度表面活性剂Tween-80,Triton X-100,SDS对大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT酶）的影响。结果表明：发酵初始添加Tween-80和Triton X-100的最适浓度分别为2％,0.5％,最终胞外酶活分别达2.03U/ml和4.92U/ml,相对于未添加表面活性剂时提高4.6倍和12.67倍,且改变添加时间不能提高酶的产量;发酵36 h添加0.02％SDS对α-CGT酶产量促进最大,最终胞外酶活达5.31U/ml,较对照组提高12.75倍。表面活性剂对α-CGT酶生产的促进作用可能是由大肠杆菌细胞内外膜渗透性增加所致,使细胞周质空间中α-CGT酶能更加快速地渗透到胞外。     

野菊花挥发油β-环糊精包合工艺

对野菊花挥发油β-环糊精包合工艺进行了研究,采用正交实验法,以β-环糊精(β-CD)和野菊花挥发油质量投料比、包合时间、包合温度为影响因素,以包合物含油率为指标,优选包合工艺。结果表明:最佳包合条件为β-CD和野菊花挥发油质量投料比为8:1,包合时间为2h,包合温度为40℃。     

GH42家族保守氨基酸位点累积突变对Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响

【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响。【方法】在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303与F341进行累积突变。【结果】与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为30%;GOS最大得率由0.75%提高到19.50%。【结论】家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性。     

亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。