植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成，反应体系成分简单、环境友好。然而，绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小，需要加入无机盐维持最适催化环境，增加了生产附加成分。此外，随着产物γ-氨基丁酸的生成，溶液pH会逐渐上升，不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD，基于酶蛋白表面电荷修饰，选择9个位点进行定点突变及组合突变，酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高，尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活，为野生酶的1.68倍。接下来，通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外，将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达，通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃，菌体量OD₆₀₀=20，底物L-谷氨酸100.0 g/L，5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中，不调节pH，通过分批投料底物L-谷氨酸，γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L，较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活，提高了γ氨基丁酸的转化效率，为实现其规模化工业生产奠定了基础。