嗜热革节孢多糖单加氧酶氧化方式

多糖单加氧酶(polysaccharidemonooxygenase,PMO)是一种铜离子依赖的氧化酶,属于辅助活性酶类第九家族(auxiliary activity 9,AA9),在存在电子供体维生素C(vitamin C,Vc)的情况下,可以氧化裂解纤维素的多糖链,显著提高纤维素的酶解效率。本文克隆了嗜热革节孢Scytalidium thermophilumAA9家族的一个编码基因pmo7651,并在毕赤酵母GS115进行诱导表达,通过His标签获得了重组蛋白PMO7651-His。以磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物进行酶促反应,薄层层析法(TLC)结果显示PMO7651酶解产物主要为纤维二糖至纤维五糖;飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和溴氧化法确定PMO7651具有C1、C4、C6位的氧化活性;底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响;在PMO7651帮助下,纤维素酶的降解效率均具有不同程度的提高。     

嗜热毁丝菌外切葡聚糖苷酶CBH1环状结构对酶活性及热稳定性的影响

糖苷水解酶第七家族(GH7)的外切葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase),又称为纤维素生物降解酶(CBHs),在其催化中心活性通道的顶端有1个环状结构,嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)第七家族外切葡聚糖苷酶CBH1的环状结构(LS,Loop Structure)由9个氨基酸组成,即G245-Y253,但其对酶特性影响机制尚不清楚。本文构建环状结构缺失突变体CBH1-DM﹝Δ(G245-Y253)﹞以研究该结构对酶特性的影响。野生酶WT与突变酶CBH1-DM通过毕赤酵母表达并纯化,将纯化产物进行酶学性质的测定及分析。研究结果显示野生酶和突变酶的最适反应温度和最适p H值均相同,分别为50℃和5.0。CBH1-DM的比活力为2.42 U/mg,是WT(1.17 U/mg)的2.1倍。野生酶与突变酶在70℃处理1 h后,野生酶仅剩余35%的酶活力,而突变酶剩余70%的酶活力,具有较好的热稳定性。研究表明环状结构对酶的活性及热稳定性具有显著影响。     

嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的氧化特性及协同作用

以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum多糖单加氧酶CtPMO1为研究对象,利用薄层层析色谱法(TLC)、高效液相色谱-示差折光检测法(HPLC-RID)和飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测CtPMO1的酶活性,并根据定点突变的原理,将CtPMO1第1位的组氨酸(His1)和第166位的谷氨酰胺(Gln166)突变为H1A、Q166A和Q166E,研究两个突变位点是否参与CtPMO1的氧化作用;另外,采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测CtPMO1与纤维素酶(EGⅡ、BGLⅠ和CBHⅠ)的协同效应。研究发现CtPMO1在温度为50 ℃、pH为5.0的条件下降解磷酸膨胀纤维素(PASC),其酶解产物中不仅存在纤维二糖至纤维五糖,还存在C1氧化寡糖和C4氧化寡糖;此外,发现突变酶H1A完全丧失了酶活,Q166A丧失了C1和C4氧化活性,而Q166E保留了部分C1氧化活性;通过对CtPMO1与纤维素酶协同作用的探究,发现利用CtPMO1预处理磷酸膨胀纤维素(PASC),分别添加EGⅡ、BGLⅠ和CBHⅠ,使还原糖产量分别提高2.10倍、2.08倍和2.16倍,协同度分别是1.022、0.799和0.875。研究结果表明CtPMO1对底物具有C1和C4氧化的功能,其反应的最适温度为50 ℃、最适pH为5.0;CtPMO1活性中心氨基酸His1和平坦表面氨基酸Gln166均是关键性位点;CtPMO1预处理PASC,使纤维素酶的降解效率发生不同程度的提高。