变铅青链霉菌对噬菌体φHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系

变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性,遗传学杂交结果揭示,ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体,构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒,命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外,还携带了大约１１ｋｂ的外源片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实,这个外源片段来源于ＪＴ４６,但在ＺＸ１中完全消失。利用转座子Ｔｎ４５６０对该克隆进行诱变定位,获得了中断噬菌体抗性基因表达的衍生质粒,并已证实Ｔｎ４５６０插入在一个２．５ｋｂ的ＢｄｍＨＩ一ＥｃｏＲＩ片段上。     

变铅青链霉菌与放线菌噬菌体φHAU3相互关系的研究

变铅青链霉菌ＺＸ１,是由变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变后产生的一株修饰基因突变株,与其亲本ＪＴ４６相比,ＺＸ１除了与ＤＮＡ降解有关的基因发生了突变（Ｄｎｄ－,即该突变株的ＤＮＡ在含有Ｆｅ２＋的缓冲液中电泳不受到降解,而野生型变铅青链霉菌在同样条件下则遭到降解）以外,对噬菌体　ＨＡＵ３的抗性也随之消失,这项特征主要表现在噬菌斑大小和成斑单位（效价）上的显著变化。研究结果表明,噬菌体　ＨＡＵ３以同等的频率吸附野生型变铅青链霉菌及其突变菌株ＺＸ１,从　ＨＡＵ３基因组中没有克隆到被变铅青链霉菌识别的特异性靶位点;噬菌体ＨＡＵ３的ＤＮＡ也可以转染野生型变铅青链霉菌原生质,但其释放的噬菌体粒子只能感染突变菌株ＺＸ１,而不能感染野生型变铅青链霉菌。噬菌体ＨＡＵ３在突变株ＺＸ１中的繁殖遵循一步生长曲线,单菌释放量大约为１００,而　ＨＡＵ３感染野生型变铅青链霉菌后,则检测不到噬菌体的释放。     

噬菌体φHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的定位

ＨＡＵ３是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验表明,ＨＡＵ３可以整合到吸水链霉菌应城变种１０－２２和变铅青链霉菌６６的突变体ＺＸ１的染色体中,形成溶原,其溶原菌自发释放ＨＡＵ３,不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较ＨＡＵ３衍生噬粒ｐＩＪ８３００的ＤＮＡ酶切片段在加热前、后电泳带谱的区别,将ＨＡＵ３的ｃｏｓ位点在ｐＩＪ８３００的图谱上得到了定位。还利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的方法定位了ＨＡＵ３与宿主形成溶原时附着位点（ａｔｔＰ）,并利用脉冲电泳技术定位了在变铅青链霉菌ＺＸ７和吸水链霉菌应城变种１０－２２中形成溶原的附着位点（ａｔｔＢ）。这些信息均有利于以ＨＡＵ３为基础的载体的发展和优化。     

噬菌体ψHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的…

ψＨＡＵ３是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验表明,ψＨＡＵ３可以整合到吸水链霉菌应城变种１０－２２和变铅青链霉菌６６的突变体ＺＸ１的染色体中,形成溶原,其溶原菌自发释放ψＨＡＵ３,不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较ψＨＡＵ３衍生噬粒ＰＩＪ８３００的ＤＮＡ酶切片段的中热前、后电泳带谱的区别,将ψＨＡＵ３的ｃｏｓ位点在ＰＩＪ８３００的图谱上得到了定位。还利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的     

变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株,编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上,中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在,其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性,其氨基酸序列的同一性高达３７％,相似性达５８％,而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的,该区域与λ的复制无关。此外,这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％,低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。     

人肿瘤坏死因子基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

以质粒ｐＩＪ４８６为载体,将来源于质粒ｐＨＴ１的肿瘤坏死坏因子（ＴＮＦ－ａ）ｃＤＮＡ克隆至变铅青链霉菌,以新霉素（３０μｇ／ｍｌ）为选择标记,获得了数百转化子,实验表明Ｎｏ．７转化子ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ５４－ＨＴ所含重组质粒ｐＩＪＴ７已克隆有ＴＮＦｃＤＮＡ。Ｌ９２９细胞毒实验结果表明该转化子ＴＮＦ表达量可达１０＾８活性单位／升以上,中和实验确证其表达产物为人ＴＮＦ－ａ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明克     

转座子Tn5096对刺孢吸水链霉菌北京变种PR220转座的诱变

用大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒ｐＣＺＡ１６８多次转化农抗１２０产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种ＲＦ２２０的原生质体,均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种１０－２２突变株的链霉菌质粒ｐＩＪ７０２可以转化ＲＦ２２０,但转化频率只有数十个转化子／μｇＤＮＡ。用来自ＲＦ２２０本身的ｐＩＪ７０２对消除ｐＩＪ７０２后的ＲＦ２２０的原生质体进行了再转化,转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理ＲＦ２２０的菌     

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因的启动子活性检测、转录起始点的确定

分别从重组质粒ｐＵＢ１及其Ｍ（１３）亚克隆Ｓ１中将７号淀粉酶链霉菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓＮｏ．７）Ｍ１０３３（以下简称Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３）木糖异构酶基因的－１９２－＋５８１ｂｐ片段克隆入链霉菌启动子探测质粒ｐＩＪ４０８３中,转化变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用Ｍ１３亚克隆Ｓ１和合成引物Ｐ６延伸制备放射性标记的单链ＤＮＡ探针;通过Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３的总ＲＮＡ的Ｓ１核酸酶保护实验,确定了其转录的起始位点,并由此探讨了与木糖异构酶基因表达有关的一些因素。     

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素cryIA(c)基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）δ内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ｐＫＫ２２３３重组,并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＩＰＴＧ诱导,获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ｐＨＺ１２７２中,得到重组质粒ｐＨＺ１２５６,将该质粒引入变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）ＪＴ４６中,经硫链丝菌素诱导,通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ测定表明,重组变铅青链霉菌ＪＴ４６（ｐＨＺ１２５６）已表达出相应的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素ＣｒｙＩＡ（ｃ）对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为９３％和５７％。     

苏云金芽孢杆菌δ—内毒素cryIA（c）基因在大肠杆菌和变铅青链？…

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽直菌δ－内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ＰＫＫ２２３－３重组,并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＩＰＴＧ诱导,获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ＰＨＺ１２７２中,得到重组质粒,ＰＨＺ１２５６,将该质粒引入变铅青链霉菌ＪＴ４６中,经硫链丝菌素诱导,通过Ｗ     

大鼠α-酰胺酶在变铅青链霉菌中的克隆及表达研究

α－酰胺酶（α－ａｍｉｄａｓｅ,α－ＡＥ）催化神经和内分泌系统中活性多肽的Ｃ－端酰胺化,多多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增获得编码α－酰胺酶的ｃＤＮＡ,并进行了克隆和测序。为了使α－酰胺酶能在链霉菌中分泌表达,将其ｃＤＮＡ与链霉菌酷氮酶酶（ｍｅｌＣ１）信号的编码序列融合得到融合ｍｅｌ／ＡＥ,将ｍｅｌ／ＡＥ插入链霉菌质粒ｐＩＪ６８０,获得重组质粒ｐＩＪ     

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因的启动子活性检测,转录起始点…

分别从重组质粒ＰＵＢ１及其Ｍ１３亚克隆Ｓ１中将７号淀粉酶链霉菌（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ Ｎｏ．７）Ｍ１０３３（以下简称Ｓ。ｄｉ．Ｍ１０３３）木糖异构酶基因的－１９２－＋５８１ｂｐ片段克隆入链霉菌启动子探测质粒ＰＩＪ４０８３中,转化变铅青链霉菌（Ｓ。ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用Ｍ１３亚克隆Ｓ１和合成引物Ｐ６延     

麦迪霉素产生菌中具强启动活性DNA片段的结构与功能分析

用启动子探针质粒ｐＩＪ４８６从麦迪霉素产生菌（Ｓ．ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）中克隆到１个具启动功能的ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ２．０ｋｂ片段,含该片段的重组质粒ｐ４Ｈ２转化子在ＭＭ基本培养基上对卡那霉素（Ｋｍ）抗性可达５００μｇ／ｍｌ以上。亚克隆缺失分析结果表明,该片段不同部分的缺失对启动活性有不同程度的影响,说明它具有较复杂的转录调控机制。ＤＮＡ序列分析结果显示,该片段含有１９８４个核苷酸,其Ｇ＋Ｃ％为４７．７％,不存在典型的链霉菌的可读框;进一步的分析发现,其６５０ｂｐ、１１５０ｂｐ和１５００ｂｐ区域分别与麦迪霉素酮基还原酶基因等链霉菌基因的启动子序列具有同源性;在５２０－５７０ｂｐ区域与大肠杆菌ｔＲＮＡ基因上游激活序列（ＵＡＳ）有较好的同源性,提示链霉菌中可能存在可增强基因转录的ＤＮＡ元件。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

pIJ6021和pIJ4123是链霉菌的高拷贝表达载体,它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子P_tipA。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因(bla),得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：pHZ1271和pHZ1272。将透明颤菌(Vitreoscillia sp.)血红蛋白基因(vhb)克隆到pHZ1272中,用它转化变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),经Western blotting分析和CO结合实验表明,在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白,从而证明所构建的pHZ1272载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。     

玫瑰红链霉菌336质粒（pSR336）DNA的分离及特性研究

从葡萄糖异构酶产生菌──玫瑰红链霉菌３３６中分离得到质粒ｐＳＲ３３６。经电泳检测和电镜观察证实,存在共价闭合超螺旋和开环两种分子构型,分子量约为６．３５ｋｂ,拷贝数约为１３０。采用高温（４０℃）,吖啶橙、溴化乙锭和ＳＤＳ等物理、化学因素消除ｐＳＲ３３６,均未获得质粒消除株,表明ｐＳＲ３３６质粒是非常稳定的。用变铅青链霉菌ＴＫ２１作受体,进行平皿杂交以检测ｐＳＲ３３６的接合转移能力,未观察到麻点（ｐｏｃｋ）的形成。用ＨｉｎｄⅢ分别酶切ｐＳＲ３３６和ｐＩＪ４８６,连接得到一个嵌合质粒ｐＩＲ３０,检测玫瑰红链霉     

球孢链霉菌质粒pSGL1的性质研究

链霉菌质粒pSGL1是本实验室在球孢链霉菌（Streptomycelglobisporus）中发现的新的质粒,它可以在变铅青链霉菌中复制。用缺失分析确定了pSGL1的基本复制区位于一个2．0kb的片段上。pSGL1能够与pIJ101相容。pSGL1是一个高拷贝质粒,拷贝数约为70～250。在对质粒进行分析的过程中得到的一些衍生质粒如pSGLN和pSGLS3等可以作为新的链霉菌基因克隆载体,并可用于构建新的高效分泌表达的链霉菌载体。     

医药其它

921368由变铅资链娜菌分泌抗生蛋白链菌素〔俄〕/Bol。-tin,A.P.…1 Antibiot.Khimioter一1091,36(6)一s~12[译自DBA,i。。1,10(25),91一10410〕 构建T一种bireplieon载体质粒pVGi4o,其中含有编码dagA基因信号肤的表达单位。将质粒pAPS中的阿维T链霉菌(“,e尹￡o仍犷eesa”￡d‘-耐落、抗生蛋白链菌素基因克隆到质粒pVG140上,获得重组质粒p VG141和pVG142。用它们转化变铅青链霉菌(5.1畜公落da.‘)Tk64,以硫链丝菌肤抗性为基础,选择含有质粒的克隆。重组菌株能够分泌抗生蛋白链菌素。检测了培养基成分和碳源对该抗生素的影响。5.1…     

嗜冷细菌弧菌菌株ABE—1中呼吸作用依赖性钠泵偶联位点

嗜冷细菌弧菌菌株ＡＢＥ－１中呼吸作用依赖性钠泵偶联位点ＹＡＳＵＨＩＲＯＴＡＫＡＤＡ．ＮＯＲＩＹＵＫＩＦＵＫＵＮＡＧＡ．ＡＮＤＳＨＯＪＩＳＡＳＡＫＩ研究了嗜冷细菌弧菌菌株ＡＢＺ－１呼吸作用依赖性原钠泵与呼吸链的偶联位点。几种抑制实验表明由呼吸作用依赖性...     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

带有木糖还原酶基因和木糖醇酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒ｐＡＪ４０１－ｘｄｈ１转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母Ｈ４７５,构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木产基因的重组酿酒酵母ＨＸ１,研究了重组酿酒酵母ＨＸ１对木听转化利用情况。