大连近海河流弧菌Ⅱ噬菌体的分离与研究

1996年、 1 997年两个夏季 (5～ 8月 )、从大连市水产养殖公司所属的不同的皱纹盘鲍养殖区采集海水及海底淤积物样品共 76个。以河流弧菌Ⅱ (Vibriofluvialis)为指示菌 ,从这些样品中分离到 1 9株噬菌体。对它们进行了电子显微镜的观察 ,结果发现它们均属于BradleyA型。进一步的血清型分析表明 ,这 1 9株噬菌体分别属于 4个血清型 ,并对这 4个血清型的代表株VP1 ,VP2 ,VP4及VP8进行了寄主范围、一次生长曲线测定及其他生物学特性的初步分析。     

家蚕核型多角体病毒广东株bro基因家族分析

对BmNPV广东株进行了空斑纯化,并对该基因组的bro基因家族进行克隆,获得4个bro基因序列(bro-a、bc、、d),与GenBank数据库中BmNPVbro基因序列及本实验室测定的重庆株的bro基因序列进行比较分析,结果表明广东株BmNPVbro基因存在插入及缺失,其氨基酸的改变主要发生在对应蛋白的N端部分;同时进行的bro基因的系统发生分析表明,广东株bro基因分别位于3个亚组中,广东株bro-d与日本T3、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A,广东株bro-a、c与T3、CQ1株bro-a、c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B,广东株bro-b与T3、CQ1株bro-b、e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C,bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征,进一步支持了Kang等的观点:bro-d是BmNPV生存所必需的,bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测:SC7株的3个bro基因可能是BmNPVbro家族出现的最简约形式。     

一种新的人兽共患传染病——狐阴道加德纳氏菌病的研究 V.狐阴道加德纳氏菌菌株的血清分型研究

将我国6个省(区)、13个主要狐场分离的145株狐阴道加德纳氏菌,进行抗原性、免疫原性测定,从每场分离菌中选出1～3个优良株进行血清型研究。凝集素交叉吸收试验证实,选出的26株菌可划分为3个血清型,以此3个血清型代表株制备因子血清,余下119株菌中,108株在所划分的3个血清型内,11株未能定型。在3个血清型中,Ⅰ型菌株数占定型菌数的79.1％,因而确定,Ⅰ型菌是国内狐场狐阴道加德纳氏菌主要流行型。试验还明确了从貉分离的5株、水貂分离的4株、犬分离的2株阴道加德纳氏菌也属于血清Ⅰ型。将3个血清型代表菌株制成超声抗原,经免疫琼脂扩散试验证实,各型抗原与同型或异型免疫血清均可形成一条明显的融合沉淀线,表明各型菌间有共同抗原成分。同型菌免疫琼脂扩散试验表明,各株菌形成的沉淀线完全融合,从而证实了血清分型的可靠性。     

一种新的人兽共患传染病——狐阴道加德纳氏菌病的研究 V.狐阴道加德纳氏菌菌株的血清分型研究

将我国6个省(区)、13个主要狐场分离的145株狐阴道加德纳氏菌,进行抗原性、免疫原性测定,从每场分离菌中选出1～3个优良株进行血清型研究。凝集素交叉吸收试验证实,选出的26株菌可划分为3个血清型,以此3个血清型代表株制备因子血清,余下119株菌中,108株在所划分的3个血清型内,11株未能定型。在3个血清型中,Ⅰ型菌株数占定型菌数的79.1％,因而确定,Ⅰ型菌是国内狐场狐阴道加德纳氏菌主要流行型。试验还明确了从貉分离的5株、水貂分离的4株、犬分离的2株阴道加德纳氏菌也属于血清Ⅰ型。将3个血清型代表菌株制成超声抗原,经免疫琼脂扩散试验证实,各型抗原与同型或异型免疫血清均可形成一条明显的融合沉淀线,表明各型菌间有共同抗原成分。同型菌免疫琼脂扩散试验表明,各株菌形成的沉淀线完全融合,从而证实了血清分型的可靠性。     

云南省1例疫苗衍生株脊髓灰质炎病毒病例的调查分析

本调查旨在了解2010年云南省昭通市1株脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗衍生毒株(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)引起的病例的流行病学特征、该病例的排毒情况及其周围健康儿童的肠道病毒(EV)携带情况和病毒型别特征。在该病例的发生地进行现场流行病学调查,连续采集病例粪便标本,采集密切接触者及病例居住地健康儿童粪便标本进行病毒分离和型别鉴定。经省级专家组最终分类诊断为VDPV病例;实验室结果显示病例标本中未再检出VDPV;密切接触者及周围健康儿童标本中均未检测到脊灰疫苗株病毒及VDPV,AFP病例入户主动搜索未发现类似病例,表明该病毒未在当地造成循环;在健康儿童中检测到NPEV 21株,病毒携带率为20.0%;经VP1区核苷酸序列测定,21株NPEV分别属于HEV-A组(11株,3个血清型,占52.4%)和HEV-B组(10株,4个血清型,47.6%)。     

辽宁省食源性副溶血性弧菌PFGE分子分型及血清型、耐药谱

目的分析辽宁省副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别及血清型、耐药谱,探讨辽宁省副溶血性弧菌污染的同源性,为食源性疾病溯源和预警提供基础。方法对50株从辽宁省2015年食源性疾病和食品中分离的副溶血性弧菌进行PFGE分子分型、血清学分型、药物敏感试验,采用BioNumerics version 6.6软件进行分析,比较同源性。结果 50株副溶血性弧菌共分为19个血清型,食源性疾病分离株分为5个血清群,主要的血清型为O3群,其次为O1群;食品分离株分为9个血清群,主要的血清型为O3群,其次为O1和O4群。50株副溶血性弧菌对15种抗生素的耐药试验,对头孢唑啉耐药率最高达72%。50株副溶血性弧菌共分为4种PFGE优势带型,相似度为90.8%~100.0%。结论辽宁省食源性副溶血性弧的血清型以O3群和O1群为主,致病菌流行株血清型为O3:K6;食品中分离菌株血清型和PFGE带型非常分散,提示这些多为遗传不相关菌株。PFGE图谱可看出,绝大部分相同血清型菌株的PFGE带型相似度很高,O3与O1血清型菌株有高度同源性密切相关,耐药菌株间PFGE带型相似度很高,均具有高度同源性。相比2014年的耐药情况,对头孢唑啉耐药率显著增高。另外,少数菌株出现多重耐药,耐药情况不容乐观。     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

2012年上海地区副溶血性弧菌血清分型和毒力基因携带状况研究

为了解2012年上海地区副溶血性弧菌人源株和食源株的优势血清型及其毒力基因携带状况,本研究收集了2012年从上海市15个区(县)腹泻患者和食品监测中分离的副溶血性弧菌株,进行血清分型,并采用聚合酶链反应(PCR)检测tdh和trh基因。结果显示,854株副溶血性弧菌中,88.1%为血清可分型,89.8%为产毒株。O3∶K6、O4∶K8、O1∶K25、O4∶K68、O4∶K9、O1∶K36、O3∶K29为上海地区可分型人源株的优势血清型(93.8%),其中O3∶K6最多,达56.2%。副溶血性弧菌全部分离株的月份分布显示出聚集趋势,7~8月为高峰期。O4∶K9和O1∶K36血清型菌株的月份分布与其他优势血清型菌株不同,未表现出明显聚集趋势。食源株无明显优势血清型,且与人源株分布不同。人源株产毒株构成(95.6%)高于食源株(5.5%)。人源株优势血清型产毒株构成(99.9%)高于非优势血清型(71.1%)。血清可分型人源株的tdh携带率(97.5%)高于不可分型人源株(67.6%),血清可分型人源株的trh携带率(0.8%)低于不可分型人源株(42.6%)。结果提示,副溶血性弧菌血清型分布与历史数据相比变化较大,血清型与毒力基因携带呈一定程度关联,且人源株与食源株在血清型和毒力基因携带上具有分离现象。因此,在副溶血性弧菌的监测与检测中应充分考虑血清分型和毒力基因的重要性。     

宁波地区环境中副溶血弧菌血清学及毒力相关基因研究

目的了解宁波地区环境来源海产品中副溶血弧菌血清学特点及毒力相关基因分布。方法采集并分离2013年6-10月宁波地区海产品中副溶血弧菌,对其进行O、K抗原血清学分型;并采用PCR或多重PCR的方法来检测溶血素基因(tlh、tdh、trh)、大流行群遗传标志基因(toxRS/new、orf8)和Ⅲ型分泌系统(T3SS1、T3SS2α、T3SS2β)基因。结果从海产品样本中分离鉴定到44株副溶血弧菌的菌株,分属于20种血清型,型别多样,未见优势血清型;溶血素基因检测发现3株tdh+trh-致病性菌株,遗传标志基因检测发现1株tdh+trh-toxRS/new+大流行株,其血清型为O3:K6型;Ⅲ型分泌系统基因检测发现T3SS1基因存在于所有的副溶血弧菌菌株中,而T3SS2α基因则主要分布在tdh+的菌株中。结论宁波地区环境中副溶血弧菌致病性菌株和大流行株的检出,说明该地区具有潜在的食源性疾病爆发的风险。     

绿脓杆菌血清型和菌素型及其与院内感染的关系探讨

自住院患儿腹泻大便中分离的115株绿脓杆菌分属于10个血清型、11个菌素型。血清型以2、6、3型多见,合占71.3％,菌素型以112431、125113、161112、142421为主,合占80.5％。并证实住院患儿感染绿脓杆菌与医院感染有关,同一血清型、菌素型的菌株易在同一病房出现。     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

猪源大肠杆菌(ETEC、STEC、AEEC)毒力基因及其与O抗原型的关系

[目的]揭示从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株所属病原型(pathotype)、毒力基因及其与O血清型的关系.[方法]O血清型采用常规的凝集试验进行测定,毒力基因采用PCR方法检测.[结果]通过对这300个分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以0149、0107、0139、093和091为主,共133株,占定型菌株的57.1%;拥有est Ⅰ、estⅡ、elt、stx2e和eae A基因的菌株分别为102(34.0%)、190(63.3%)、81(27.0%)、57(19.0%)和54(18.0%)株;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为50.7%),在K88菌株中,0149血清型与est Ⅰ或estⅡ elt密切相关,在F18菌株中,0107血清型与est Ⅰ或estⅡ、0139血清型与stx2e紧密相关.依其毒力特征可将这些分离株分为以下6种类型:ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、AEEC/ETEC和AEEC/ETEC/STEC,分别拥有190、24、36、32、17和1个菌株,占分离株的63.3%、8.0%、12.0%、10.7%、5.7%和0.3%.通过分析这些分离株的O血清型、毒素类型和黏附素型之间的相关性:猪源ETEC以0149、0107、093和098等血清型为主,0149:K88菌株主要与estⅡ或estⅡ elt肠毒素相关,0107:F18菌株主要与estⅡ相关,093和098血清型菌株主要与estⅡ肠毒素相关;STEC菌株以0139:F18血清型为主,拥有stx2e;AEEC菌株拥有紧密素,无明显优势血清型;ETEC/STEC菌株以0107:F18和0116:F18血清型为主,主要与est Ⅰ stx2e或estⅡ stx2e密切相关,ETEC/AEEC菌株以091和0107血清型为主,全部拥有肠毒素est Ⅰ和紧密素基因.[结论]我国至少存在6种病原型的猪肠道致病性大肠杆菌,其中ETEC为我国部分地区猪大肠杆菌病的主要病原,同时其病原型日益复杂.     

绿脓杆菌血清型和菌素型及其与院内感染的关系

自住院患儿腹泻大便中分离的115株绿脓杆菌分属于10个血清型、11个菌素型。血清型以2、6、3型多见,合占71.3％.菌素型以112431、125113、161112、142421为主。合占80.5％,并证实住院患儿感染绿脓杆菌与医院感染有关,同血清     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

进口水产品中单增李斯特菌的分子流行病学特点

摘要：[目的] 探明进口水产品中单增李斯特菌的污染状况、致病性和分子特征。[方法] 针对2007年7月至2008年11月间从29个国家进口的1275批水产品,进行单增李斯特菌鉴定、谱系与血清型分析、小鼠毒力试验与多位点序列分析。[结果] 检出单增李斯特菌33批次（2.6%）,其中以4b型为主（65.2%）,而1/2a型、1/2b型与1/2c型仅分别占13.0%、17.4%与4.4%。这些分离株对小鼠均具有与强毒参考株相当的毒力。基于actA-hisJ-ribC-sigB的多位点序列分析可将32个菌株分为23个序列型,分辨力达0.97。其中3个序列型包含3个以上分离株,其中序列型9属于流行性克隆I。[结论] 进口水产品中单增李斯特菌污染率与国内水产品相近,但血清型分布以4b型为主,且有流行性克隆I检出,因此要加强对进口水产品中单增李斯特菌的监测。     

应用分子生物学方法鉴定6群肺炎链球菌血清型

目的利用分子生物学方法,鉴定26株6群肺炎链球菌的血清型。方法利用6群肺炎链球菌荚膜多糖相关基因设计合成6对特异性引物,PCR扩增26株肺炎链球菌,并对PCR产物进行基因序列的测定及分析。结果26株肺炎链球菌cpsD蛋白229个氨基酸中有7个突变点,第220~222位均没有缺失;其中,19株肺炎链球菌具有与wci Nα蛋白氨基酸序列完全一致的氨基酸组成,第150位均为Ala,第38位均为Asp,其余7株与wciN_α蛋白氨基酸序列没有相似性,但与wciN_β蛋白氨基酸序列相似性超过99%;15株wciP蛋白第195位为Ser,11株wci P蛋白第195位为Asn。综合分析比对后,26株6群肺炎链球菌中,11株属于6A型肺炎链球菌,8株属于6B型肺炎链球菌,4株属于6C型肺炎链球菌,3株属于6D型肺炎链球菌。结论分子生物学方法可用于6群肺炎链球菌血清型的鉴定,为完善6群肺炎链球菌的菌种档案提供了实验依据。     

鸡传染性支气管炎病毒广西分离毒株抗原相关性的研究

本研究将26个传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)广西分离毒株以及参考株M41和常用疫苗株H120、Ma5和4/91共30个毒株,分别与根据这些毒株S1基因高变区Ⅰ的基因分型结果而选取的属于3个不同亚群的7个代表性分离毒株和常用疫苗株H120、Ma5和4/91制备的共10个单因子血清,在鸡胚气管环培养(TOC)上进行病毒中和试验,然后根据中和试验结果对1985～2008年间课题组所分离的26个IBV广西地方流行毒株与3个常用疫苗株H120、Ma5和4/91以及参考毒株M41的抗原相关性及其血清型进行分析。结果显示,30个试验的毒株分属7个不同的血清型,其中26个分离株有两个优势血清型(占总分离株的68%),分别是血清1型(包含13个毒株)和血清2型(包含5个毒株)。此外,我们还将分离毒株的血清分型结果与重要抗原基因(包括S1、N、M和3′UTR)的分型结果之间的关系进行了比较,发现它们之间的分型结果不尽相同。研究结果表明,近年来广西存在多个血清型IBV的流行而且不同时期流行的优势血清型不同,分离毒株之间以及分离毒株与疫苗毒株之间的抗原相关性也存在着差异。     

大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒基因特征分析

目的了解大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒的基因特征。方法采用荧光定量RT-PCR对2016年大连市食源性疾病监测哨点医院采集的1 900份粪便标本进行诺如病毒核酸检测,用逆转录PCR对阳性毒株的ORF1-ORF2连接区扩增并测序,分析其基因亚型和同源性。结果 1 900份标本中,检出诺如病毒核酸阳性25份,阳性率1.32%,其中GⅠ型阳性3份,GⅡ型阳性19份,GⅠ型和GⅡ型均阳性3份。26株病毒基因序列比对,发现3株为GⅠ.3,2株为GⅠ.6,9株为GⅡ.17,5株为GⅡ.4,2株为GⅡ.2,GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15各1株。结论大连地区食源性腹泻病例中诺如病毒呈基因多样性,2016年流行优势株为GⅡ.17。GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15在大连地区首次检出。     

MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定与分型的应用

目的探讨MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定和质谱分型的应用价值。方法收集2009年1月至2013年5月温州医科大学附属第二医院临床分离的112株肺炎链球菌标本,采用Optochin敏感试验和全自动细菌分析仪对收集的菌株进行鉴定验证,并用Microflex MALDI-TOF质谱仪进行分析鉴定。根据质谱图的相似性进行细菌同源聚类树分析并构建质谱分型模型,采用荚膜肿胀试验对参与分型的菌株进行血清型比较。结果除20株不符合检测条件之外,92株临床菌株和1株标准株经质谱分析均为肺炎链球菌,选取的60株菌株以0.5的差异水平,将60株肺炎链球菌分为18个质谱型别,在这些菌株的血清分型中有19F、19A、23F、23A、3和14六个血清型别,分布于不同的MALDI-TOF MS分型中,其中19F有18株,占30%(18/60),分布在6种不同的MALDI-TOF MS分型中,也有3型血清型较为集中地分布于相应的MALDI-TOF MS一个型别里。结论 MALDI-TOF MS能快速、准确、简便地鉴定肺炎链球菌,且能达到种的水平。对比血清型,按照0.5差异水平,建立的18个质谱分型部分的型别与血清型有一致性,但也存有差异。     

鸡马立克氏病毒Ⅱ型无毒株Z_4的分离和鉴定

从扬州市郊区土种鸡中分离到一株血清Ⅱ型马立克氏病毒(MDV)Z4株,并进行了鉴定。初次分离时,Z4在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长缓慢,12天后产生以圆形大合胞体为特征的空斑形态。用Z4CEF培养物接种易感鸡,13周内不引起任何马立克氏病临床症状,也无大体的病理变化,显微镜检查仅部分鸡的坐骨神经出现炎性细胞浸润。保护性实验证明,接种Z4株的鸡可抵抗MDV强毒的致瘤作用,表明它是很有希望的疫苗候选毒株。 用型特异性单克隆抗体,对MDV强毒株京-1株、弱毒株K株,以及作者新分离的另外9个分离物进行了血清型鉴定。证实京-1株、K株和5个分离物为Ⅰ型病毒;2个为Ⅱ型病毒;另有2个分离物同时含有Ⅰ型和Ⅲ型病毒。本工作为进一步研究不同血清型MDV在我国鸡群中的流行和分布规律打下了基础。