禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株毒力及其相关基因的研究

用测定新城疫病毒(NDV)毒力的经典方法,即鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),对源于鸡、鸽、鹅、珍珠鸡、孔雀、鹌鹑和画眉鸟等7种禽(鸟)源的共14个禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)广西分离株,分别测定了毒力。同时对分离株F基因的N一端前段和HN基因的e末端片段进行扩增、测序和分析,并绘制系谱树。结果发现,分离株的MDT在36h～75h之间,除1株鸽源毒株gxp22的ICPI值为0外,其余分离株在1．09～1．95之间;除孔雀源的分离株gxpc52在F基因裂解位点附近的氨基酸序列为^112R-RQ-R-R-F^117之外,其它13株均为^112R-R-Q-K-R-F^117,都符合强毒株的特征。所有分离株与国内参考强毒株F48E8和国外参考强毒株HER／33在HN基因e末端终止密码子的位置相同,也符合强毒株的特征。根据F基因核苷酸序列绘制的系谱树发现,近几年来在广西流行的APMV-1毒株的基因型为Ⅶd亚型;根据HN基因核苷酸序列绘制的系谱树表明,广西各种禽源APMV-1分离株可分为2个群。研究的结果表明,根据F基因裂解位点附近的氨基酸序列和HN蛋白翻译的终止密码子的位置判定APMV-1毒力的结果,都与毒株在临床上的致病情况相符。因此,根据F基因和HN基因序列和结构的特征,均可以判定APMV-1临床分离株的体内致病性。     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

鸡传染性支气管炎病毒广西分离毒株抗原相关性的研究

本研究将26个传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)广西分离毒株以及参考株M41和常用疫苗株H120、Ma5和4/91共30个毒株,分别与根据这些毒株S1基因高变区Ⅰ的基因分型结果而选取的属于3个不同亚群的7个代表性分离毒株和常用疫苗株H120、Ma5和4/91制备的共10个单因子血清,在鸡胚气管环培养(TOC)上进行病毒中和试验,然后根据中和试验结果对1985～2008年间课题组所分离的26个IBV广西地方流行毒株与3个常用疫苗株H120、Ma5和4/91以及参考毒株M41的抗原相关性及其血清型进行分析。结果显示,30个试验的毒株分属7个不同的血清型,其中26个分离株有两个优势血清型(占总分离株的68%),分别是血清1型(包含13个毒株)和血清2型(包含5个毒株)。此外,我们还将分离毒株的血清分型结果与重要抗原基因(包括S1、N、M和3′UTR)的分型结果之间的关系进行了比较,发现它们之间的分型结果不尽相同。研究结果表明,近年来广西存在多个血清型IBV的流行而且不同时期流行的优势血清型不同,分离毒株之间以及分离毒株与疫苗毒株之间的抗原相关性也存在着差异。     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒(IBV)(命名GX-YES),通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究,同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的SI基因和N基因并测定其核苷酸序列.结果表明:该病毒株有间接血凝性;致病性较强;血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4/91.同源性分析表明,SI基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5%～81.2%和50.7%～78.8%;N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7%～87.2%和89.5%～91.7%;SI基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远.SI基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合.本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株,这可能是目前免疫失败的重要因素,同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础.     

马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株3'端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3'端非编码区(3'UTR)的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3'UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3'UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3'UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低(54.4%～75.5%);3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3'UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。     

广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析

对广西1985～2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒(IBV)的S1基因高变区Ⅰ(HVR Ⅰ)进行序列测定,并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析.系统进化关系显示毒株可分为5个基因群,其中有16个广西分离株属第Ⅰ群,它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高,与Massachusetts(Mass)型疫苗株的同源性较低.有15个分离株在33～34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入,GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入;GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近,同属于第Ⅱ群;GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近,属于第Ⅲ群;GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4/91亲缘关系较近,属于第V群.结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行,毒株S1基因HVR Ⅰ碱基的突变或插入比较普遍,可导致其氨基酸序列的变化,绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低.同一时期的分离株同源性较高,但无明显的地域性差异.     

广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析

对广西1985-2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒（IBV）的S1基因高变区I（HVRI）进行序列测定，并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析。系统进化关系显示毒株可分为5个基因群，其中有16个广西分离株属第1群，它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高，与Massachusetts（Mass）型疫苗株的同源性较低。有15个分离株在33-34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入，GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入；GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近，同属于第Ⅱ群；GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近，属于第Ⅲ群；GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4／91亲缘关系较近，属于第V群。结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行，毒株S1基因HVRI碱基的突变或插入比较普遍，可导致其氨基酸序列的变化，绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低。同一时期的分离株同源性较高，但无明显的地域性差异。