用Gateway 系统构建携带Grb2-SH2 基因重组慢病毒载体

目的:构建携带Grb2-SH2基因重组慢病毒载体。方法:把Grb2-SH2基因从合成的工程载体PUC-57中导到入门载体pentr-3C中,再利用LR反应重组到目的载体plenti,通过酶切和测序分析对比验证Grb2-SH2基因后,将plenti-Grb2-SH2质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞获得携带Grb2-SH2慢病毒载体。结果:构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确,目的基因片段大小约为500bp;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,转染效率约为90%。结论:成功构建转载质粒plenti-Grb2-SH2及携带Grb2-SH2基因慢病毒载体。     

重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING,并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体,为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL,抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物,扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域,通过重组PCR,将SH2分别与U—box、RING进行融合,融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK293T细胞,Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp,SH2一RING大小为633bp,重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING,转染HEK293T细胞后能够正确表达,为后续研究奠定了基础。     

人β2-glycoprotein I及其第V结构域蛋白的原核表达、纯化和活性鉴定

目的:旨在重组表达人源β₂-GPI及其第V结构域基因,探讨后者在抗自身免疫性动脉粥样硬化实验中的干预作用。方法:以实验室保存的CTA727-1重组质粒为模板克隆β₂-GPI及其第V结构域基因,构建pET32-β₂-GPI和pET32-DV重组表达载体,分别转化至大肠杆菌Rosetta-gami。经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并采用Western blot、HPTLC和ELISA方法验证了重组蛋白的活性与功能。结果:β₂-GPI及其第V结构域目的基因被分别克隆至原核表达载体pET-32a-c(+),诱导出具备CL和oxLig-1结合活性的β₂-GPI 及第V结构域融合蛋白,ELISA实验显示第V结构域融合蛋白可抑制oxLig-1/(r)β₂-GPI/Antibody免疫复合物的形成。结论:成功构建了pET32-β₂-GPI及pET32-DV表达载体,获得高水平表达且具备活性的β₂-GPI 和第V结构域重组蛋白,为研究治疗动脉粥样硬化等疾病的多肽药物奠定了基础。     

人类新基因Bzw2的克隆、抗体制备及表达分析

Bzw2( basic leucine zipper and W2 domains 2)基因是人类心脏发育候选基因,它由bzip结构域和W2结构域构成.为了研究该基因在心脏发育过程中的作用,利用生物信息学信息克隆了人类Bzw2基因全长,将所得的片段插入到原核表达载体pGEXT-4T-1载体中,利用BL21菌株表达该重组...     

SH2D4A互作蛋白的筛选及初步鉴定

SH2D4A是SH2蛋白家族成员之一,可能参与酪氨酸蛋白激酶相关受体介导的信号转导,调节细胞的生长、增殖和分化,进而影响人类疾病的发生。为明确SH2D4A在细胞信号转导通路中的作用机制,本研究运用酵母双杂交技术筛选SH2D4A相互作用蛋白,并利用GST pull-down实验进行了初步鉴定。首先成功构建了酵母诱饵蛋白重组表达载体pGBKT7-SH2D4A;利用该重组体对人肾脏cDNA文库进行逐级筛选,共得到46个阳性克隆;经目的基因分离,DNA测序及BLAST软件序列比对分析发现5种可能的SH2D4A互作蛋白（AZGP1、DAD1、HSD17B10、KAT5和PKM2）;NetPhos 2.0 Server软件预测结果显示除HSD17B10外其他4种蛋白均含有磷酸化酪氨酸;进一步以KAT5和HSD17B10作为代表进行GST pull-down,证实两者均可直接结合SH2D4A。以上结果为深入研究SH2D4A的功能奠定了基础。     

β2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定

为提高β2－肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2－肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。     

UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板,PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段,各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上;将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株）,IPTG诱导表达各GST融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化;纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2功能打下了基础。     

甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析(英文稿)

非特异脂质转移蛋白（nsLTP）是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用qRT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体pET32a中,对重组菌BL21（pET32a-LTP）的耐盐性进行分析。序列分析表明：IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明：IbLTP1和IbLTP2均含有nsLTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于Type Ⅰ而IbLTP2属于Type Ⅱ。实时荧光定量PCR分析表明：IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在NaCl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对NaCl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。     

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36％左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗（重组蛋白羧基端带有6xHis）发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。     

人MACC1-SH3基因片段的克隆、表达载体的构建与转染

目的:本研究构建MACC1-SH3基因的真核表达栽体,为进一步研究MACC1-SH3在结肠癌细胞转移中的作用机理奠定基础.方法:本研究通过RT-PCR方法从人转移性结肠癌细胞SNU-C1中获得MACC1-SH3基因片段,并插入pRc/CMV真核表达栽体.将该质粒转染SW480结肠癌细胞株.结果:将工程菌扩增后的质粒经双酶切鉴定和基因测序证实插入片段为MACC1-SH3基因,并得到含有pRc/CMV-MACC1-SH3质粒的结肠癌细胞株.结论:通过基因工程技术构建pRc/CMV-MACC1-SH3质粒载体,并成功转染结肠癌细胞株.     

重组大肠杆菌表达氧化还原酶不对称还原2-羟基苯乙酮的研究

将来源于7种微生物的13个氧化还原酶基因分别与表达载体pET21c连接后,转化入Escherichia coli BL21(DE3)中,得到13株重组菌.重组菌在IPTG诱导下进行表达,并对2-羟基苯乙酮进行不对称催化还原.研究发现,在17℃下诱导表达的重组酶比活明显高于30℃和37℃下诱导表达的比活.另外,来源于Ca...     

日本对虾Bcl-2基因的cDNA克隆与抗寒功能研究

为研究B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma, Bcl-2) 基因在内源性细胞凋亡通路中发挥的重要调控作用, 实验利用cDNA末端快速扩增(RACE) 技术克隆获得日本对虾(Marsupenaeus japonicus)MjBcl-2 基因cDNA全长序列, 并对其序列进行生物信息学分析; 利用实时定量PCR (qPCR) 技术分析了MjBcl-2在不同组织、不同水温胁迫及RNA干扰后的表达水平; 同时利用TUNEL技术, 检测MjBcl-2 干扰后的细胞凋亡情况。结果显示: 日本对虾MjBcl-2 cDNA全长为2432 bp, 开放阅读框长度为726 bp, 共编码241个氨基酸, 分子量为26.80 kD; 结构域预测分析表明MjBcl-2 含有Bcl-2家族典型的保守结构域; 多序列比对以及进化树构建结果表明, MjBcl-2与其他物种的相似度较高, 保守性较强。定量PCR结果显示, MjBcl-2在日本对虾各个组织中均有表达, 肌肉中表达量最高, 鳃次之, 心脏中表达量最低。低温(10℃和16℃)胁迫下日本对虾鳃和肝胰腺Bcl-2基因的表达量逐渐上升, 在72h到达最高点; 在干扰Bcl-2基因后, 各个温度Bcl-2基因的表达量均下调, 细胞凋亡基因Caspase-3的表达量显著上调(P<0.05) 。TUNEL检测结果表明, RNAi组和NC组(对照组) 随着温度的降低, 凋亡细胞数量不断增加, 在28℃处理组中有少量凋亡细胞, RNAi组与NC组凋亡细胞的数量没有明显的变化, 在10℃低温处理组中, RNAi组凋亡细胞的数量明显高于NC组; 12h后, 28℃ NC组、28℃ RNAi组、10℃ NC组和10℃ RNAi组中鳃组织的细胞凋亡率分别为1.73%、2.35%、21.59%和33.70%。研究表明, MjBcl-2在日本对虾应对低温胁迫中发挥重要作用。     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3（NF）(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体Lipofectamine^TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

雌激素受体β转录激活系统的构建

目的：构建雌激素受体β（ERβ）的转录激活系统。方法：以pcDNA3-ERβ质粒为模板,利用PCR技术扩增ERβ全长及转录激活结构域1（AF1）、DNA结合结构域（DBD）、转录激活结构域2（AF2）等不同长度的基因片段,分别插入pGAL载体中,构建重组质粒,转染293T细胞,利用免疫杂交方法鉴定其表达情况,用萤光素酶报告基因（Gal4-LUC）检测转录活性。结果：构建了ERβ全长及不同功能区片段编码基因的重组质粒,转染293T细胞后检测到相应蛋白的表达;在活性实验中,雌激素（E2）诱导下pGAL-ERβ使Gal4-LUC活性升高约17倍,pGAL-ERβAF1在有无E2诱导下均能使Gal4-LUC活性升高2倍,pGAL-ERβAF2在E2诱导下使Gal4-LUC活性升高约7倍,pGAL-ERβDBD对Gal4-LUC活性没有明显作用。结论：ERβ的转录激活系统构建成功。     

整合素αMβ2 I-结构域的基因合成和蛋白表达

目的：利用大肠杆菌表达系统表达整合素αMβ2 I-结构域,并对其进行纯化。方法与结果：利用DNAWorks在线引物程序设计经过密码子优化的整合素αMβ2 I-结构域的寡核苷酸序列;采用PCR介导的基因拼装法合成αMβ2 I-结构域DNA模板,将其克隆至原核表达载体pET11d-6h上,并转化大肠杆菌,获得表达菌株;经IPTG诱导,αMβ2 I-结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化后,纯度达到90％以上;电喷雾电离质谱测定表明纯化所得的蛋白精确的相对分子质量为23720.0,与预期值相符;肽指纹质谱图谱鉴定其为目的蛋白。结论：αMβ2 I-结构域的高效表达,为进一步研究其与配体的结合及其复合物晶体结构奠定了基础。     

鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达

根据国外巳发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白（VP2-VP3）基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株（GPV CC株）的VP2-VP3基因。将扩增的目的的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPV,VP2-VP3基因的原核载体pEGVP1。重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75000和58000的表达蛋白带。Western blot分析表明,表达产物具有很好的特异性。