鸡补体分子C3d的基因克隆及结构分析

目的:克隆鸡补体分子C3d基因并解析其结构特点。方法:将已发表的人、小鼠、地鼠、奶牛、野兔、猪、猩猩、绵羊的C3d基因同鸡的C3α链进行序列比较分析,发现在鸡的C3α链上有一段约897bp的序列同上述动物有较高的同源性,在上下端保守区域设计一对引物788bp,应用RT-PCR扩增鸡C3d部分基因,并克隆到pMD18-T载体中,测序正确后再在上下端分别设计一对引物,理论长度分别为378和336bp,最后用3种PCR产物延伸扩出C3d全长序列。结果:获得了鸡C3d基因重组质粒pMD18-C3d,序列分析表明所获的鸡C3dcDNA全长为993bp,编码331个氨基酸残基。鸡与上述人或动物C3d核苷酸的同源性分别为66.6%、66.2%、67.7%、66.2%、67.1%、67.0%、59.6%、67.1%,与其编码的氨基酸的同源性分别为61.5%、61.9%、61.2%、61.9%、56.5%、61.9%、54.5%、61.5%;而哺乳动物间C3d的核苷酸和氨基酸的同源性则分别为74.2%～100%和72.2%～100%。进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。结论:鸡C3d与其他动物的C3d在抗原结合位点上没有氨基酸的变化,而与CR2结合的28肽区氨基酸差异明显,说明鸡C3d结合抗原没有专一性,而结合免疫细胞则有种的特异性,由此可以推测鸡C3d只能增强鸡的特异性免疫反应。     

表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病.IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属,其基因组由A和B两个节段组成.研究表明,IBDV主要的抗原性及致病性位点均位于A片段,其中VP2蛋白具有血清型特异性位点,并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体,是该病毒的主要抗原.     

副结核荧光PCR试剂盒研制与应用

采用TaqMan荧光标记探针技术原理, 建立副结核分枝杆菌特异的实时荧光PCR快速检测鉴定方法并组装形成临床诊断试剂盒。试剂盒提供荧光PCR与样品核酸提取试剂, 检测全程包括样品处理可在1 d内完成。特异性试验结果表明, 试剂盒对8株副结核分枝杆菌标准菌株的检测均呈典型阳性反应, 对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌等其它12种分枝杆菌标准菌株以及大肠杆菌、肺炎链球菌等多种常见微生物均呈阴性反应。试剂盒检测灵敏度可达单个菌细胞、15个基因拷贝, 比常规PCR检测灵敏度提高100倍。对每份添加50~100个菌细胞的20份阴性牛奶样品进行检测, 均呈阳性反应。重复性试验结果显示, 试剂盒组内变异系数为1.41%, 组间变异系数为2.42%。采用所研制的副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒对来自广东地区7个奶牛场的250份牛奶样品和粪便样品、来自10个养猪场的143份猪血清样品, 以及3批次进口食蟹猴共100份血清样品进行检测, 检出牛奶样品中副结核分枝杆菌阳性率为7.7%, 牛粪样品中阳性率为3.7%, 猪血清样品中阳性率为8.2%, 进口猴血清样品中阳性率为3.0%。     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。