pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建

目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础.方法:pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-).首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheⅠ/XhoⅠ之间;接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnⅠ/ HindⅢ之间,最后XhoⅠ/KpnⅠ双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可.酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达.pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp.第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp.第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-l+2,以Bcl和Kpn Ⅰ分别酶切pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-l+2置换入pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL.结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1 (-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论:成功构建pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础.     

重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING,并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体,为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL,抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物,扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域,通过重组PCR,将SH2分别与U—box、RING进行融合,融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK293T细胞,Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp,SH2一RING大小为633bp,重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING,转染HEK293T细胞后能够正确表达,为后续研究奠定了基础。     

IGFBP-2的结构功能与调控及其与肿瘤关系的研究进展

IGFBP-2作为IGFBP超家族最受关注的分子之一,在多种肿瘤中都发现其表达增加,通过调控肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭以及内皮募集和血管生成等多种过程,在肿瘤的发生与发展中起着重要作用。IGFBP-2的功能复杂多样,受细胞类型与细胞微环境的影响,其表达含量与肿瘤进程关系紧密,并且与抑癌基因PTEN的表达呈反相关。本文综述了IGFBP-2蛋白结构、功能、调控及其与肿瘤关系的研究进展,为将IGFBP-2作为新的肿瘤治疗靶点提供依据。     

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PTB分别与U-box、RING进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HeLa细胞,Western 印迹验证重组质粒的表达.结果 PCR结果显示PTB-U-box条带大小840 bp,PTB-RING大小为620 bp,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论 成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box和 pFLAG-CMV4-PTB-RING,并且转染HeLa细胞后证实其能够正确表达.     

基于生物信息学的抑癌基因NDRG2相互作用蛋白预测及验证

NDRG2(N Myc downstream regulator gene 2)是NDRG 家族成员之一. 以往研究表明,该家族与细胞的增殖和分化有关. 而该分子参与的细胞信号通路及调节机制尚未阐明. 本研究利用保守蛋白间相互作用（interologs）的生物信息学方法预测NDRG2相互作用分子,并通过免疫共沉淀（Co-IP）及His pull-down蛋白体外结合实验方法对预测结果进行验证. 生物信息学软件预测和分析结果表明,细胞中存在多个可能与NDRG2发生相互作用分子.结合文献报道,从中选取了3个候选分子Gnb1、 Rgs16及 Rgs5进行分子生物学实验验证.Co-IP及His pull-down实验结果表明,3个候选分子中,Rgs5蛋白能够和NDRG2蛋白相互作用,而其它2个候选分子与NDRG2的相互作用未获得实验室方法的验证.研究结果表明,生物信息学分析与实验室验证相结合是一种高效省时的蛋白质相互作用研究策略.通过这种策略证实NDRG2可以与 Rgs5蛋白相互作用,为后续NDRG2功能的研究提供了有效的线索.     

重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

目的：构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG—CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF（TNFReceptorAssociatedFactor）家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法：分别设计引物,扩增tTRIP（TRAF-interactingprotein）分子C端伸展的coiled．coiled结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box结构域,再利用重组PCR,将tTRlP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG．CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果：PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP—U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论：成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4一tTRIP-U—box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。     

蜕皮激素诱导MIIP基因的表达对肝癌细胞增殖迁移的影响

目的:探讨蜕皮激素诱导迁移侵袭抑制蛋白基因(migration and invasion inhibitory protein,MIIP)基因的表达对肝癌细胞SK-Hep-1增殖和迁移能力的影响。方法:采用PCR扩增MIIP基因,连入T载体测序正确后,插入到蜕皮激素可诱导真核表达载体pIND中。将pIND-MIIP和含蜕皮激素受体基因的表达载体pVgRXR以脂质体转染法转染到SK-Hep-1中,经G418和Zeocin双抗生素筛选获得稳定转染细胞株。蜕皮激素Ponasterone A诱导后,采用Western blot检测MIIP表达,CCK-8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移。结果:蜕皮激素诱导MIIP表达上调后,SK-Hep-1细胞的增殖能力显著下降(P0.05),细胞的迁移能力明显减弱。结论:建立了MIIP基因可诱导表达系统,证实在肝癌细胞SK-Hep-1中MIIP过表达可抑制细胞的增殖及迁移能力。     

生物化学“TCA”特色课程思政模式的构建与应用

高等教育“四新”建设(新工科、新医科、新农科、新文科)背景下，生物化学课程思政建设质量直接关乎育人成效。本校经过6年生物化学课程思政教学实践，以学科重要名词三羧酸循环中的“TCA”(三羧酸)类比育人的“一心三力”(T-思考力与合作力、C-鉴别力、A-敬畏心),由此提出生物化学大学科通用的“TCA”特色思政理念，分别引导学生建立正确的认知观、科学观和生命观。同时构建了实现该理念、具有可操作性的实践创新体系，包括“一课三融”教的理念、“成长三思”学的理念、“创学三境”深度学习环境序贯创设，能够满足不同学校学情进而灵活设计高阶教学活动的基本需求。本校应用该模式，构建了突显军医大学特色的“TCA白兰鸽”生物化学思政体系，“白”代表医学，“兰”代表空军，“鸽”代表和平和谐。运用上述教与学的理念、学习环境序贯创设方法，个性化设计瞄准高阶育人目标的三大教学活动，包括“魔力生化圈”共学平台，注重主动建构与个性输出的思维训练；“基础-临床双师大班互动”启学课堂，侧重深度思考与讨论迭代的思辨表达；“虚拟仿真(VR)沉浸式任务”乐学应用，关注应对复杂与纠错担当的思感升华。上述“TCA白兰鸽”育人效果较满意，...