质粒YRP7的基本特性鉴定

质粒YRP7用氯霉素法扩增,碱变性裂解法提取,酸酚法及核糖核酸酶纯化后,得到了高产量(5.6mg/L培养液),高纯度(A260:A280=2.0)的质粒制品,经转化实验及酶切分析确定YRP7具有下列特征:大小为5.41±0.10kb,可赋予宿主细胞AmP~r、Tet~r的表型,对大肠杆菌C600的转化频率为10~(-6)、转化效率为1.5×10~6转化子/mgDNA。限制性内切酶BamH Ⅰ、ECoRⅠ、Hind Ⅲ及PstⅠ在其分子上的切点数分别为1、2、2、2,并确定了各酶切片段的分子大小,对BanHⅠ的单切点,经插入失活法证实其位于Tet~r的基因上。由上述特征可确定,质粒YRP7是一个比较理想的克隆载体。     

谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145自发缺失突变体的特性及其重组质粒的构建

用谷氨酸棒杆菌质粒pxz10145转化钝齿棒杆菌T 6—13原生质体,得到自发缺失突变体pNAT65,该质粒为2．4kb,仍带有氯霉素抗性,经物理图谱分析表明,质粒pxz10145smaⅠ到claⅠ位点之间的片段已缺失,仍保留EcoRⅠ、XbaⅠ、BclⅠ三个酶的单切点。质粒pNAT65与pBR322用EcoRⅠ酶切连接得到重组质粒pNAR67,这一质粒在E．Coli中复制并表现Ap, Tc抗性,但氯霉素抗性能力大大降低,只能抗2μg／ml。     

质粒pXZ10145核苷酸序列测定和分析

以Sanger双脱氧中止法为原理,利用美国ABI公司370A自动核酸序列分析仪,我们测定了谷氨酸棒杆菌质粒pxzl0145全长4887bp的核苷酸序列,该质粒上存在包括ApaI等18种限制酶的单一切点,其它限制酶切点的数目和位置也被定出,质粒上有8个可能的阅读框架,通过序列分析,我们确定了pxzlO145断裂生成缺失突变体pNAT65的两侧位点,在两个断裂点上发现存在“ATCTAGC”7个碱基的同向重复序列。     

多酶单一切点Tac启动子质粒pTL的组建与应用

本工作组建了一个含Tac启动子(promoter)的表达载体质粒pTL。pTL带有Trp-35区、Lac-10区及两个终止区(t_1t_2),并带有EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstI及HindⅢ等单一酶切点,可以在这些切点中插入各种基因片段,由Tac启动子促进基因的表达。在Ap抗性基因中无PstⅠ切点,故在PstⅠ切点插入外源基因后,Ap抗性不受影响。用pTL表达人干扰素αD基因,获得较高的产率,每立升菌液约得8.2×10~7单位,相当于每立升4mg干扰素。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1) 的分子克隆和特性研究

以大肠杆菌和酵母菌穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600或HB101为受体构建成酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Hind I基因文库。从基因文库中提取重组DNA转化酵母受体XSB44-35D(a,pgk1,leu1,ade1,trp1,gal1),选出转化体Pgk1+琼脂糖凝腔电泳指出所插入的DNA片段长度为3．1kb。PGKl DNA片段插入的方向性是此基因的5’-。侧翼区靠近pCN60的BamH I位点,而3’-侧翼区接近Bg1 I位点。Cla I,EcoRV,Kpn I,Xba I,Pst I,Hind Ⅱ,BamH I及Pvu I等核酸内切酶制作的酶切图谱的结果表明,除报道的PGK酶切位点外,还发现一个新的Kpn I及一个新的Cla I位点。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

一个含有乳链菌肽抗性基因的乳酸乳球菌质粒pTS50的鉴定

在添加乳链菌肽、乳糖及溴甲酚紫的M1 7选择培养基上 ,从 1 97个新鲜牛奶样品中筛选到 3株乳链菌肽抗性菌株 ,PCR扩增证实它们都含有乳链菌肽抗性基因。菌种生理生化特性鉴定及特异性 1 6SrDNAPCR扩增产物的序列测定结果表明这 3株菌都属于乳酸乳球菌乳酸亚种。质粒转化实验发现乳酸乳球菌乳酸亚种TS 1 640中的乳链菌肽抗性基因位于一个约47kb的大质粒pTS50上。BamHI、EcoRI、HindⅢ、NcoI、PstⅠ酶切分析和Southern杂交 ,进一步将乳链菌肽抗性基因定位于pTS50的一个约 1 9kbEcoRI酶切片段中     

氧化硫硫杆菌pTt54质粒的限制性酶切分析及其在大肠杆菌中的克隆

对pTt54质粒进行了限制性酶切分析,实验证明pTt54质粒上有一个EcoRI切点和一个Sau3Ai切点,无BamHI、BclI,BglII、HindIII,Sall、XhoI、Kpnl、PvuII、Pstl切点。绘出了该质粒的酶切图谱,分子量为2.14Kb。pTt54质粒分别通过EcoRI位点和BamHI位点与pBR 325质粒重组,得到了重组质粒pSDT541和pSDT542,这两个质粒均可作为氧化硫硫杆菌遗传信息转移系统的载体。     

脂肪嗜热芽孢杆菌质粒pFD101的限制性内切酶图谱

从脂肪嗜热芽孢杆菌T525中抽提得到的隐蔽性质粒pFD101,经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,确证为cccDNA。经测定,pFD101的分子量为3.83×10~6道尔顿。具有限制酶HindⅢ切点1个、SalⅠ和HpaⅡ切点各2个,没有EcoRI、BamHI和PstⅠ切点。根据限制酶片段的分子量作出了pFD101的简单酶切图。     

具有真细菌基因启动子活性的盐生盐杆菌质粒DNA片段

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体、用两组限制性内切酶ＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ和ＨｉｎｄⅢ－ＳａｌＩ分别消化盐生盐杆菌Ｊ７（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）的质粒ｐＨＨ２０５,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择平板上筛选转化子,并从随机挑选的２０株转化子中,获得抗氯霉素水平达到１１０μｇ／ｍｌ的转化子Ｔ１和Ｔ２,所含重组质粒分别被命名为ｐＪＨ和ｐＪＢ。经限制性酶切分析及杂交分析表明,ｐＪＨ质粒上插入了一段来源于ｐＨＨ２０５质粒的ＤＮＡ片段,其大小为８００ｂｐ左右。通过重新转化实验进一步表明,该ＤＮＡ片段在大肠杆菌中具有启动子功能,从而证明,在古细菌（盐生盐杆菌）的质粒ＤＮＡ中存在具有真细菌（大肠杆菌）基因启动子活性的ＤＮＡ片段。     

一种简单的哺乳动物细胞附着体质粒CaCl2转化方法

目的:建立一种简单经济的哺乳动物细胞附着体质粒还原实验方法。方法:构建附着体载体,转染中国卵巢仓鼠(CHO)细胞和小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a,利用改良的赫特裂解法提取附着体质粒,CaCl2法转化附着质粒至宿主菌大肠杆菌DH5α,再次从DH5α中提取质粒,将转染前后质粒用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切,并将转染前后的质粒进行DNA测序分析。结果:与最初转染的质粒相比,还原质粒双酶切和单酶切后的条带大小一致;DNA测序分析表明,转染前后质粒中的插入序列相同。结论:建立了可用于质粒还原实验的简单的CaCl2转化方法。     

大肠杆菌抗药性质粒pFD3的链霉素抗性表达

Cohen等‘31研究大肠杆菌抗药性质粒R6 （此质粒携带卡那霉素、新霉素、氯霉素、四环 素、链霉素抗性）,发现在用卡那霉素抗性、新 霉素抗性或氯霉素抗性作为选择性标记进行转 化时,极少数转化子失掉链霉素抗性。本文报 道大肠杆菌抗药性质粒pFD 3（此质粒携带四 环素、链霉素、氯霉素、氨苇青霉素、磺胺抗性） 在经结合转移或转化途径传递给大肠杆菌C'₆₀₀ 时,所得的转移子、转化子中四环素、氯霉素、氨 苇青霉素及磺胺抗性都能正确表达,而链霉素 抗性则不能完全表达。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

芽孢杆菌分泌型表达载体的构建

以地衣芽孢杆菌(B．Lichenformis)α－淀粉酶信号肽编码区为基础构建了具有Pst I、NheⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ多酶切点的芽孢杆菌分泌型载体pAMY403,其分泌效率与质粒pAMY 413相同,而表达水平提高了50％,并能使外源β－内酰胺酶基因正常表达和分泌。粒pAMY403多酶切点可以满足外源基因插入产生非融合蛋白质,也可满足以三种不同读码框架插入外源基因产生融合蛋白质,因而能适应构建不同分泌型工程菌株的要求。     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1和T4DNA连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

含花生根瘤菌吸氢基因重组质粒pZ-55的特性分析

应用含豌豆根瘤菌部分吸氢基因的探针及PCR分析,从花生根瘤菌基因文库中筛选到含有吸氢基因的重组质粒pZ-55。用BamHⅠ、EcoRⅠ和KpnⅠ等内切酶对pZ-55 进行酶切分析,构建了pZ-55的酶切物理图谱。经三亲本杂交分析,pZ-55能互补诱变株Ln-1（Hup     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/Hin dⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后加收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3．3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT－1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100％,解离后的质粒稳定性为93％。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1 和T4DNA 连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA 进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2 确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA 转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌励基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1．8kb的地基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat．经EcoRI—HindⅢ双酶切后得到妇基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E．coli BW25113／pIJ790中得到E．coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌纽基因的序列及质粒pIJ773（pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒）中阿泊拉抗性基因（aac（3）iv）的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的纽基因两端的互补序列,以质粒pip73为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有纽基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E-coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的纽基因同源序列与pGH112-lat中的野生型勉基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入地基因中,得到纽基因中插入阿泊拉抗性基因（lat：：apr）的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌地基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。