Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb高效沉默表达载体的构建及转化表达

淀粉分支酶（starch branching enzyme, SBE）是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米（Zea mays）淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体pTFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)甘蓝植株

以下胚轴、带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)导人甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株。经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明:农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株。经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

马铃薯不同组织的诱导分化及其对遗传转化效率的影响

在农业快速发展过程中,基因工程作为改造马铃薯性状的重要手段,一直备受关注。优化马铃薯组织培养体系及外源基因转化条件是进行马铃薯转基因工作的基础。以三种熟性不同的马铃薯栽培品种（东农303、早大白、大西洋）的试管苗为试验材料,采用正交实验,对茎段和试管薯的分化体系进行筛选、优化,建立不同品种茎段的愈伤再生体系及试管薯直接分化再生体系。将以LYCB为目的基因,以NPTII为筛选标记的载体,利用农杆菌转化法,分别对三种材料试管苗的茎段及试管薯进行转基因操作,并对转化条件进行优化,以建立适合于不同品种马铃薯茎段及试管薯的遗传转化体系。以研究中得到的最佳离体再生体系及最优遗传转化体系为基础,利用PCR方法,进行阳性植株检测并统计。研究发现,在东农303、早大白、大西洋三种品种中,经由茎段愈伤组织转化,获得的阳性植株转化率分别为36%、35%、28%;经由试管薯直接分化,获得的阳性植株转化率分别为43%、45%、17%。在后期转基因操作中,东农303/早大白转化时可采用试管薯作为试验组织,大西洋则适合用茎段。     

根癌农杆菌介导的CMO基因转化马铃薯的研究

通过根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A 驱动的菠菜胆碱单加氧酶(CMO)基因导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它( Favorita)中,获得了抗卡那霉素再生植株,对转化植株进行PCR检测初步表明CMO基因已整 合到转基因马铃薯基因组中.并对光照强度对马铃薯试管薯遗传转化的影响进行了研究,结果表明在诱导芽分化的过程中,2 000 lx的光照强度有利于试管薯薄片直接再生出抗性芽.     

复合调控Wx与SBE3基因对水稻籽粒直链淀粉含量的影响

颗粒淀粉合成酶（GBSS）和淀粉分支酶3（SBE3）是淀粉合成过程中的两个关键酶,这两个酶主要由耽和SBE3两个基因分别控制,它们的表达量直接影响直链淀粉和支链淀粉的含量比例。为了探讨水稻淀粉关键酶基因耽过量与SBE3干涉复合表达对直链淀粉含量的影响,构建了Wx过量表达与SBE3干涉结合的多基因表达载体,并通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴水稻中。经过PCR检测分析获得了65株转基因阳性植株,半定量RT—PCR检测表明转基因株系中Wx基因表达量明显增加,而SBE3基因表达量显著减少。转基因株系籽粒透明度明显降低,直链淀粉含量比野生型的平均高45％,但是千粒重变化不大,与野生型相当。遗传分析表明这些转基因株系多数可稳定遗传。     

一种加工型马铃薯品种的农杆菌转化体系研究

大西洋马铃薯是经济价值很高的炸片型加工品种,逆境胁迫下,易产生褐变、空心等问题,影响加工品质。为获取抗逆境胁迫的优质转基因新品种,采用根癌农杆菌介导法,以大西洋马铃薯的茎段为外植体,建立了快速,简便,高效的遗传转化体系。从共培养到转化植株获得只需7-8周,转化频率达80%。结果表明茎段是较好的转化受体,硫代硫酸银可以有效促进不定芽分化并提高再生频率。PCR、Southern杂交分析证明外源基因已经成功整合到马铃薯再生植株的基因组中。该转化体系为大量开发转基因马铃薯植株,进而筛选优质的马铃薯炸片加工型新品种奠定基础。     

猕猴桃L-艾杜糖脱氢酶基因的克隆及转化

以猕猴桃果实为材料,利用电子克隆技术获得了L-艾杜糖脱氢酶(L-Idonate dehydrogenase,IDH)基因,然后将其转入番茄中,为了解猕猴桃IDH基因如何调控AsA的降解奠定基础。结果表明,获得的猕猴桃IDH基因cDNA全长为1 239bp,含有一个1 080bp的开放阅读框,编码359个氨基酸;成功构建了IDH基因植物表达载体pWR-IDH及工程农杆菌,以番茄叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法进行转化,获得了4株经PCR和RT-PCR检测呈阳性的转基因植株。     

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。     

人降钙素基因相关肽转基因马铃薯的RT-PCR分析

报道经过农杆菌介导将人降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)基因由马铃薯块茎专一表达classIpatatin基因5′侧翼区和CaMV35S启动子驱动构建的马铃薯表达载体导入马铃薯,PCR鉴定获得了转基因植株。RTPCR分析证实classIpatatin基因5′侧翼区驱动的CGRPmRNA在转基因马铃薯中的表达。研究结果在开发转基因马铃薯生物反应器表达医用多肽中具有重要意义。     

根癌农杆菌介导天花粉蛋白基因TCS转化茎瘤芥的研究

以茎瘤芥(Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因导入到茎瘤芥中。对所获得的31株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为23株;Northern blot分析结果表明基因TCS在转基因植株中能够正常表达。转基因植株接种病毒试验结果表明,转基因TCS的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virus, PLRV)中国分离株的基因间隔区(intergenic sequence, IS)双链cDNA以正、反向两种方式分别构建于转化载体pROK2中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Desiree,获得了转基因植株.卡那霉素抗性分析和PCR检测目的基因,证明PLRV IS双链cDNA已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中.将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种PLRV,观察症状并用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测转基因植株中PLRV含量.结果表明,表达PLRV IS正意和反意RNA的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,PLRV平均滴度均较未转基因对照植株低.表达正意RNA的转基因植株PLRV滴度降低43%～72%,表达反意RNA的转基因植株PLRV滴度降低72%～86%,由此可见,表达PLRV IS反意RNA的转基因马铃薯对PLRV抗性较强.     

茎尖法转基因棉花植株真实性鉴定方法探究

棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA（16S rRNA）片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。     

红阳猕猴桃遗传转化体系的建立

以红阳猕猴桃叶片和茎段为实验材料,通过优化培养基,建立了一个高效的红阳猕猴桃遗传转化体系,利用农杆菌介导转化法把猕猴桃ACO基因(ACC oxidase gene)的反义链导入红阳猕猴桃,共获得47株潮霉素抗性植株.随机挑选其中14株进行PCR鉴定,其中9株成功扩增到了目的条带,初步统计阳性植株为64.3%左右.此研究为利用分子遗传基因工程手段培育优质延熟保鲜的转基因猕猴桃新品种打下了基础.     

Shiva A 基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum pv tabaci)的抗性

利用农杆菌介导的方法转化烟草外植体,通过抑菌圈实验和试管苗抗菌能力鉴定实验,表明表达采用植物偏爱密码子人工合成的抗菌肽Shva A基因的转基因烟草植株对烟草青枯病的抗病性上升。其中转基因植株Sc-4和Sc-6植株的R1代试管苗与对照植株相比较,它们的病情指数分别下降了42.1%和60.6%。     

Class I patatin基因5′侧翼区驱动的GUS基因在马铃薯块茎中专一性表达

将1.4kb Class I patatin基因的5′侧翼区与GUS基因融合,构建了双元表达载体pPATIs(含patatin部分信号顺序)和pPATI(不含patatin部分信号顺序)。pPATI通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯品种Desiree。X-Gluc染色(PATIs不能染色)及PCR结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,GUS的表达进一步用荧光进行定量检测,结果显示,PATI-GUS的转基因植株中GUS比活性均以块茎明显高于茎段,达10-20倍。蔗糖浓度的升高,PATI-GUS植株中的GUS比活性无明显变化,与前人报道有不同。此外,光照促进PATI-GUS的表达。     

蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究

通过基因沉默技术调控蓖麻毒蛋白A链基因的表达,以期获得低毒蓖麻新材料.利用基因克隆技术获得蓖麻毒蛋白A链基因762 bp片段,命名为RTA基因.进一步利用该基因构建了植物RNAi表达载体pBI-RTA-S-AS,通过农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,用卡那抗性筛选转化再生植株,PCR进一步鉴定转基因植株.结果表明:克隆得到目的基因长762 bp,与预期结果一致;卡那抗性筛选和PCR鉴定结果显示,获得了3株转基因阳性植株.     

植物介导的RNA干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的转基因番茄的研究

本研究构建了植物干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的载体pBI-RNAi;建立了番茄再生体系和番茄农杆菌侵染后的再生体系;并利用该体系转化了对照空载体pBI121和干扰载体pBi-RNAi,经过卡那霉素抗性筛选和基因组DNA中报告基因及RNAi片段的PCR检测筛选,一共获得5株pBI121转化的阳性植株,获得9株p BI-RNAi转化的阳性植株。该研究为今后进行转基因植株介导的干扰线虫目的基因的表达,降低线虫侵染能力的研究奠定了基础。     

农杆菌介导的高羊茅高效遗传转化和转基因植株再生

用带有质粒pDBA121(含hpt基因和bar基因)的农杆菌EHA 105转化高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)胚性悬浮细胞,建立了可重复的、高效的农杆菌介导的高羊茅遗传转化系统.商业用的除草剂Basta直接用于转化细胞的筛选.基因型、受体材料的类型、培养基成分和筛选剂影响农杆菌介导的转化频率.悬浮细胞的农杆菌转化效率为每克悬浮细胞再生2.85～10.9株转基因植株,大大高于基因枪法的高羊茅转化效率(2～5株).经PCR分析和Southern杂交检测表明,bar基因已整合进入高羊茅基因组,转基因植株Basta喷洒试验表明bar基因已成功地实现高水平的表达.此转化系统的建立为高效地将外源有用基因导入高羊茅并高效稳定地表达奠定了基础.