ELISA检测人降钙素基因相关肽在转基因马铃薯块茎中的专一性表达

通过间接ELISA检测了人CGRP基因在转基因马铃薯中的表达。马铃薯class I patatin基因5'侧翼区驱动下人CGRP的表达表现了明显的块茎专一性,茎段中没有检测到CGRP活性,CGRP的表达量在不同转基因株系中有差异,最高达到约50ng/mg可溶性蛋白。     

马铃薯classⅠpatatin基因家族的一个新亚型

马铃薯class Ⅰ与classⅡ patatin基因是具有不同组织表达专一性的一个多基因家族。用马铃薯classⅡ patatin启动子为探针,从中国马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种“东农303”基因文库中筛选到一个classⅠpatatin基因。测定其DNA顺序1.8kb;它包括patatin基因5′侧翼区1407bD、结构基因363bp。根据5′端非翻译区顺序,它属classⅠpatatin基因。该基因的5′侧翼区同已报道6种classⅠpatatin基因亚型5′侧翼区之间存在较大片段的缺失与插入,它可能是一新的classⅠpatatin亚型。     

马铃薯块茎特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化研究

为获得高效表达人白细胞介素-12(h IL-12)蛋白的转基因马铃薯植株,利用根瘤农杆菌侵染法将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的h IL-12植物表达载体导入马铃薯,通过共培养、筛选、分化等过程获得转基因植株,并结合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析对转基因植株进行鉴定。结果显示,获得12个马铃薯转基因株系,PCR检测表明其中的10个株系目的基因已导入马铃薯基因组,转基因阳性率为83%;RT-PCR分析表明其中的7个株系外源基因在转录水平成功获得表达,ELISA分析表明其中的5个株系有明显的蛋白水平表达。对这7个株系后代的检测表明外源基因成功表达且具有良好的遗传稳定性。     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

过表达Dbtnbt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇含量

本文通过克隆3′-N-去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰转移酶（3′-N-debenzoyltaxol-N-benzoyltransferase,DBTNBT）基因Dbtnbt,构建其表达载体p1303-SDbtnbtN,转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系. 转基因细胞分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;转基因细胞的Dbtnbt mRNA表达量是未转化细胞的1.33 倍;转基因细胞的紫杉醇产量约为27.3 μg/g,是未转化细胞的1.37倍. 本研究结果表明,过表达Dbtnbt基因将中国红豆杉细胞的紫杉醇产量提高约37%.     

非编码序列对仙台病毒HN基因表达的调控作用

仙台病毒的血凝素神经氨酸酶 (HN)蛋白在COS 7细胞中得到了表达 .结果表明 ,SRα启动子驱动HN基因表达的活性高于鸡 β肌动蛋白启动子 .而且 ,HN基因的 5′非编码序列能促进其表达 .Northern杂交证明 ,高表达是由HN mRNA转录引起 .为研究HN基因 5′编码序列对其转录的调控作用 ,用位点专一性突变分别以角蛋白基因和细胞色素P45 0基因的 5′非编码序列替代HN基因的 5′非编码序列 ,并分别缺失HN基因 3′非编码序列 ,构建了一系列表达载体 .以氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因为报道基因 ,用S1酶对HN mRNA转录量进行定量分析 .实验证明 ,HN基因 5′非编码序列能非特异性提高HN mRNA的转录 ,3′非编码序列对其转录也有某种特殊的调控作用 .     

hOPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型的建立

目的:建立带有人类骨保护素OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型,为OPG体内转录水平的表达调控研究和药物筛选创造条件。方法:将克隆到的人类OPG基因5′端上游6.0kb非翻译序列作为启动子,大肠杆菌编码β半乳糖苷酶的LacZ基因作为报告基因,构建表达载体pCINeoOPGLacZ。经显微操作注射到受精卵原核中,经PCR以及Southern印迹杂交鉴定转基因阳性小鼠;用RTPCR分析LacZ在组织中的表达;利用邻硝基苯βD半乳吡喃糖苷(ONPG)作为底物反应后比色分析组织中的β半乳糖苷酶活性。结果:构建完成的表达载体pCINeoOPGLacZ质粒经酶切和测序鉴定序列正确,线性化后显微注射。PCR以及Southern印迹杂交鉴定获得了10只转基因小鼠(Founders),经交配繁育,建立了5个转基因小鼠系,RTPCR分析表明其中一个系小鼠组织中表达LacZ基因,与内源OPG表达模式一致,组织中可以广泛检测到相应的β半乳糖苷酶活性。结论:成功建立了人类OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠,为体内研究OPG转录水平的表达及药物筛选提供了理想的动物模型。     

芜菁类黄酮3′-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3′-羟化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H）是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁BrF3′H1和赤丸芜菁BrF3′H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了BrF3′H1和BrF3′H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用BrF3′H1P和BrF3′H2P序列替换pCAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了BrF3′H1P和BrF3′H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,BrF3′H1P和BrF3′H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。BrF3′H1和BrF3′H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3′H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。     

La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究

分别以小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′区 2 .6kb和羊β 乳球蛋白 (BLG)基因5′区 5kb为调控序列 ,构建了乳腺表达人集落剌激因子 (G -CSF)及组织纤溶酶原激活剂突变体 (La- tPA)载体 .利用显微注射法分别建立了G -CSF和La -tPA的转基因小鼠 ,在获得G -CSF和La -tPA表达基础上 ,采用 2种转基因小鼠交配的方式 ,对后代仔鼠进行了双引物同步PCR检测 ,筛选并建立了La- tPA和G -CSF的双转基因鼠 ,研究了不同转基因在小鼠体内共表达的情况 .Northernblot分析表明 ,在一些双转基因鼠中表达出La- tPA和G -CSF .后代鼠的一些基本特征为 ,产仔数明显低于正常鼠 ,双转基因占 46 .1 %,雌雄比例基本正常 .双转基因鼠的建立为未来利用转基因动物生产多种蛋白质提供依据 .     

贵州矮马IGF-I启动子-529 CpG甲基化及个别核苷酸变异与贵州矮马矮小表型有关

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors,IGFs）和生长（激）素（growth hormone,GH）是动物机体主要的促生长因子,它们的表达水平直接决定成熟个体的高度。贵州矮马的体高明显低于伊犁马等大型马,但其原因尚不清楚。本研究从贵州矮马基因组DNA中克隆了GH和IGF-I基因5′-侧翼序列,分别为239 bp和817 bp,包括部分启动子结构;进而采用生物信息学、比较基因组学方法对比分析了贵州矮马与伊犁马两个基因5′-侧翼序列/启动子的转录因子结合位点及潜在甲基化位点（CpG岛）分布。亚硫酸氢盐PCR测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）显示,两个马群的GH基因5′-侧翼区域（239 bp）内的6个CpG位点均发生了甲基化,甲基化频率无明显差异。然而,在IGF-I基因5′-侧翼区的148 bp片段内含有4个CpG位点中,贵州矮马的-529 bp处CpG位点的甲基化程度明显高于伊犁马（P < 0.01）,且该甲基化位点处于基本启动子邻近3′端;此外,两个马群IGF-I基因5′-侧翼区的-561 bp处检测到T、C碱基改变,导致贵州矮马的顺式调控元件/转录因子结合位点较伊犁马少1个,有可能影响IGF-I基因的转录效率。血清IGF-I浓度测定揭示,贵州矮马血清IGF-I含量极显著低于伊犁马（P< 0.01）。Spearman相关性结果显示,贵州矮马及伊犁马的IGF-Ⅰ基因甲基化频率与血清IGF-I浓度呈中度负相关（r=-0.468）,提示IGF-Ⅰ基因甲基化抑制其编码蛋白质的表达。结果证明,IGF-I启动子高甲基化及某些核苷酸（碱基）序列变异可能是贵州矮马个体矮小的部分原因。