男性性腺功能减退症的致病基因分析

[目的]通过全外显子组测序(WES)技术筛选男性性腺功能减退症的致病基因,并对基因突变位点进行生物信息学分析。[方法]收集5例男性性腺功能减退症患者临床及遗传学检测资料。采用WES技术筛选相关致病基因,并通过PCR扩增、Sanger测序以及生物信息学分析等验证突变位点。[结果]先证者1为PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)纯合突变,家系验证结果发现其父母均为PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)杂合突变携带者,符合常染色体隐性遗传。先证者2为ZFPM2基因c.1498C>G(p.Q500E)杂合突变,生物信息学分析发现,该突变位点编码的氨基酸在不同物种中高度保守,并在人类外显子数据库、参考人群千人基因组1000G、SNP数据库及人群基因组突变频率数据库中未发现该突变位点,该突变经SIFT、Polyphen2和Mutation Taster软件预测结果均为有害。[结论]PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)和ZFPM2基因c.1498C>G(p.Q500E)突变可能是男性性腺功能减退症的致病原因。     

一例急性间歇性血卟啉病病例报道及文献回顾

目的:对患有急性间歇性血卟啉病先证者及其两位直系亲属进行基因突变的分析。方法:采用PCR和一代测序技术分别对患者的HMBS基因的外显子及其旁翼区进行序列分析。结果:检测出先证者HMBS基因11号外显子的旁翼区发生杂合突变c.651+2AG,为剪切突变;从先证者母亲以及女儿的HMBS基因上检测出同样的突变位点。结论:根据先证者的家族史、临床表现及相关代谢检查结果诊断为血卟啉病;基因检测结果提示先证者为急性间歇性血卟啉病;先证者的母亲和女儿存在同样的突变位点,提示先证者母亲及其女儿均患有急性间歇性血卟啉病。     

汉族马凡综合征(MFS)患者FBN1基因两种新发突变分析

为调查马凡综合征(Marfan syndrome, MFS)患者的原纤维蛋白-1(Fibrillin-1, FBN1)基因突变情况, 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(Denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)对MFS患者的FBN1基因进行突变筛查, 对DHPLC初筛异常的DNA片段进行测序分析。结果在两个MFS家系中发现FBN1基因两种新的突变: 一种为复合突变包含第55号外显子的缺失突变c.6862_6871delGGCTGTGTAG (p.Gly2288MetfsX109)、同义突变c.6861A>G和内含子的突变c.[6871+1_6871+11delGTAAGAGGATC; 6871+34dupCATCAGAAGTGACAGTGGACA]; 另一种为第20号外显子的错义突变c.2462G>A(p.Cys821Tyr)。研究表明, FBN1基因的缺失突变c.[6862_6871delGGCTGTGTAG; 6871+1_6871+11delGTAAGAGGATC] (p.Gly2288MetfsX109)和错义突变c.2462G>A(p.Cys821Tyr)可能分别是这两个家系患者的致病原因。     

牦牛KAP6-1和KAP6-4基因序列变异分析

角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)是毛纤维的主要结构成分。以甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和野血牦牛为研究对象,应用PCR-SSCP方法检测KAP6-1和KAP6-4基因外显子序列多态性。结果表明4个牦牛群体的KAP6-1基因外显子区存在c.42TC、c.135CT的同义突变及c.173GC、c.175GT的非同义突变,导致p.Cys58Ser和p.Gly59Cys的氨基酸残基改变;另外检测到1处45 bp的插入/缺失突变导致16个氨基酸残基的插入/缺失;甘南牦牛PIC值0.222 3为低度多态,其他3个牦牛群体PIC值0.393 4~0.4672为中度多态。牦牛KAP6-4基因外显子区检测到c.51CT、c.54CA、c.78TC、c.96TC和c.135TC的同义突变,以及c.118AG的非同义突变,导致编码的氨基酸残基p.Ser40Gly的改变;4类群牦牛PIC值为0.2658~0.387 2为中度多态。聚类分析表明牦牛KAP6-1基因外显子区碱基序列与普通牛、绵羊和山羊的同源性最高,其亲缘关系和系统进化远近一致。     

家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因复合杂合突变分析

目的:对1例临床确诊为纯合型家族性高胆固醇血症(FH)先证者及其核心家系成员进行基因检测分析,探讨患儿发病的分子病理基础.方法:收集先证者及父母血标本及临床资料,酚氯仿法提取基因组DNA,DNA直接测序方法检测低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因18个外显子和启动子及载脂蛋白B(ApoB100)R3500Q位点,核苷酸序列分析结果与Gen Bank比对寻找突变.结果:(1)先证者三尖瓣轻度关闭不全,先证者父母双侧颈总动脉内-中膜增厚,先证者母亲左侧颈内动脉起始处后壁多发混合回声斑块(2)该家系排除ApoB100基因R3500Q突变;(3)先证者LDL-R基因第13外显子发生A606T和D601Y复合杂合突变,前者第1879位G→A碱基置换,导致丙氨酸改变为苏氨酸,后者为1864位G>T碱基置换,导致天冬氨酸改变为酪氨酸,其父为携带A606T突变的杂合子,其母为携带D601Y突变的杂合子.结论:先证者LDL-R基因存在A606T和D601Y复合杂合突变,它们分别来源于父系及母系遗传.     

利用外显子测序在高度近视家系中鉴定一个新的NYX基因错义突变

高度近视是一种常见的眼科遗传性疾病,是导致患者视力丧失甚至失明的主要原因,其高患病率和高致盲率给广大患者的生活、工作、学习造成了极大的痛苦。在本研究中,我们收集到一个来自广西地区的三代高度近视家系,收集家系中17个成员的临床资料,抽取外周血,提取基因组DNA,应用外显子测序的方法分析所有外显子序列,运用Sanger测序在该家系中验证外显子测序的结果,发现NYX基因一个新的错义突变c.790A>T(p.N264Y)在该家系中与疾病表型共分离,在1000Genomes、ESP6500和ExAc等数据库及100例对照中,均排除该罕见突变。已有研究显示,NYX基因c.792C>G(p.N264K)突变与先天性静止性夜盲有关,表明NYX基因第264位氨基酸的不同变异可能导致不同的表型。我们的发现扩大了NYX基因的突变谱,为阐明其基因型-表型关系提供了有价值的信息。     

水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析

为了揭示牛科物种INHA基因的遗传特征,该文采用PCR产物直接测序法对水牛、大额牛和牦牛INHA基因外显子1及其侧翼序列进行多态性检测,并结合已发表的包括牛科物种在内的一些哺乳动物数据进行了比较分析。结果表明,在水牛INHA基因外显子1中存在c.73C>A替换,为同义替换,河流型和沼泽型水牛编码产物一致;在大额牛的INHA基因外显子1中发现c.62C>T、c.187G>A替换,分别引起INHA中氨基酸发生p.P21L、p.V63M改变,两者均为相同性质氨基酸的替换;在牦牛中发现c.62C>T、c.129A>G替换,前者也引起编码氨基酸发生p.P21L替换,后者为同义替换。在INHA基因5’侧翼区所测出的序列中,水牛、大额牛和牦牛等物种内均未发现SNP位点,但在种间发现存在c.-6T>G的替换,大额牛、牦牛和普通牛均为c.-6G,而水牛为c.-6T。在INHA基因内含子中,水牛的第31～36位核苷酸处发现有6个碱基的缺失,即c.262+31₂62+36delTCTGAC;该位点在河流型水牛中野生型（+/+）占主体,而在沼泽型水牛中则缺失型（-/-）占主体。在大额牛、牦牛和普通牛等其它牛科物种的内含子中均未发现该缺失,但与水牛相比,大额牛、牦牛和普通牛内含子中发现缺失c.262+78₂62+79delTG。序列比对显示,INHA基因外显子1序列中c.43A和c.67G为水牛中所特有,而c.173A和c.255G为大额牛、牦牛和普通牛所共有,c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所特有。大额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外显子1序列差异较小,而山羊和水牛与它们间的差异相对较大。     

中国遗传性胰腺炎患者胰蛋白酶原基因多位点杂合突变及其临床特征

用基因产物直接测序法对2个遗传性胰腺炎家系中胰腺炎患者(共有4例成员)的胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen,PRSS1)5个外显子进行测序,并分析其各自的临床特征.在4例胰腺炎患者中均出现了PRSS1基因杂合突变,但两家系PRSS1基因突变的位点不同,且临床表现差异较大,其中家系1出现6例糖尿病患者且发病年龄较家系2明显延迟,平均发病年龄为29岁,分析其PRSS1基因发现3号外显子336位碱基存在G→A杂合性突变,为中性突变,表达的氨基酸从赖氨酸(Lys)→赖氨酸(Lys),同时在同一外显子的361位碱基还存在另一个G→A杂合性突变,造成121位的丙氨酸(Ala)被苏氨酸(Thr)所取代,胰蛋白酶原的空间结构发生改变,其与抑制因子的结合位点消失,"保护失败"而产生有活性的胰蛋白酶,造成胰腺自身的消化.而家系2未发现糖尿病患者,其胰腺炎患者的血清肿瘤标志物不增高,先证者(Ⅲ8)在胰腺炎发病过程中表现为CD4 T/CD8 Tcell和乙肝表面抗体(anti-HBs)随病程进展逐渐降低,而Ⅲ7不表现出此现象,分析其PRSS1基因发现3号外显子361位碱基同样存在G→A(c.361G→A)突变,而且在415位还存在一个杂合性突变点T→A(c.415T→A),其中c.415T→A不存在于Ⅲ7.胰蛋白酶原基因存在多种形式的突变,而且与临床表型相关.     

遗传性先天无虹膜患者的PAX6基因新突变(c.1286delC)

摘要: 为了研究遗传性先天无虹膜(Hereditary congenital aniridia)患者发病的分子遗传学机制, 采用PCR扩增PAX6基因编码区的11个外显子(exon 4-13)及外显子和内含子相连接的区域、PCR产物直接测序的方法对1个遗传性先天无虹膜家系的所有成员进行了遗传突变分析。结果表明, 在家系中两个患者的PAX6基因exon 11均存在c. 1286delC新突变。此单个碱基的缺失造成了移码突变, 导致肽链自309位氨基酸开始产生一段含55个氨基酸的异常肽段, 并产生提前终止密码子(Premature termination codon, PTC), 使PAX6蛋白羧基端的59个氨基酸缺失。另外, 通过PCR-RFLP分析的方法对家系中所有正常成员和50名中国汉族健康对照个体基因组DNA进行分析均未检测到该突变。     

Goosecoid基因突变与先天性小耳畸形的关系

目的:对收集的43例先天性小耳畸形患者进行遗传因素分析,对Goosecoid(GSC)基因测序,探讨GSC基因与先天性小耳畸形的关系。方法:采集43例小耳畸形患者的外周血提取基因组DNA,对GSC基因的三个外显子分别设计引物,经PCR扩增纯化后直接测序。结果:6例患者在第二外显子的第197bp处发生了C→T的同义突变,编码氨基酸仍为酪氨酸;2例患者在第三外显子的第125bp处发生了A→G的错义突变,编码氨基酸由谷氨酸变成谷氨酰胺。结论:在先天性小耳畸形的患者中发现了GSC基因的突变。     

NOTCH3基因c.520T>G突变致CADASIL一家系报告及文献复习

目的:研究探讨一CADASIL家系的临床特征及基因突变情况。方法:收集同一家系中3例CADASIL患者的临床资料,并对3例患者及先证者之兄进行全外显子测序(Whole Exome Sequencing, WES)。结果:该家系中3例患者临床表现多样,女性患者均有头痛病史,先证者及先证者之姐中年起病,先证者临床表现缺乏特异性,主要表现为头昏,认知功能检查正常,心理评估示轻度焦虑抑郁状态。先证者之姐主要表现为假性球麻痹及锥体束受损,认知功能检查示重度痴呆。先证者之女自4岁起诊断为癫痫-失神发作,认知功能检查示轻度认知功能障碍。影像学显示该家系3例患者均有脑白质病变,且随着年龄增大呈进行性发展,WES显示3例患者均存在NOTCH3基因第4外显子区域杂合突变:c.520T>G,导致氨基酸改变p.Cys174Gly。结论:NOTCH3基因c.520T>G所致该家系的临床表现具有多样性,且该家系中下一代起病较早,临床表现可与父代具有较大异质性,影像学表现可在青少年时期出现,并呈现进行加重的趋势。WES显示该家系中NOTCH3基因突变为第4外显子的杂合突变,该位点突变致CADASIL为国内首次报道。     

两例抗凝血蛋白缺乏患者的基因诊断

目的:探讨导致蛋白C、蛋白S、抗凝血酶缺乏症的分子发病机制。方法:检测蛋白C活性(PC:C)、蛋白S活性(PS:C)以及抗凝血酶活性(AT:C);PCR法分别扩增患者PC、PS、AT基因序列,寻找突变点。结果:蛋白C合并蛋白S合并抗凝血酶AT缺乏患者PC基因启动子区域存在C4867T杂合突变(NG_016323.1),为蛋白C基因的多态性位点;在蛋白S基因第四号外显子区域有G68395T杂合突变(NG_009813.1),导致Arg90Leu(NP_000304.2),为国际首次报道。遗传性PS缺陷在家系:四名家系成员均检测到PS基因第四号外显子区域一个杂合(错义)突变,G68395T(NG_009813.1)。结论:PC基因启动子的多态性位点C4867T杂合突变(NG_016323.1),PS基因第四号外显子区域的G68395T杂合突变(NG_009813.1),可能是导致患者PC、PS联合缺乏的原因。PS基因第四号外显子区域G68395T(NG_009813.1)杂合突变,可能是导致PS缺陷症家系成员PS缺乏的原因。     

肌萎缩侧索硬化患者SOD1基因突变检测及突变与临床表型的关系

应用PCR技术结合DNA直接测序方法对8例临床确诊为家族性肌萎缩侧索硬化(Familiar amyotrophic lateral sclerosis,FALS)家系的先证者进行铜锌超氧化物歧化酶基因(SOD1)的突变筛查,在3例先证者中检出2种SOD1基因突变,其中,2例携带了位于4号外显子的错义突变Cys111Tyr(c.332G>A),另1例携带了位于5号外显子的错义突变Gly147Asp(c.440G>A),这2种突变在中国ALS患者中属首次报道。该结果扩大了中国FALS患者的SOD1基因突变谱,对研究中国FALS患者SOD1基因突变特点和分布规律有一定帮助。分析携带这2个突变患者的临床特点,提示Cys111Tyr突变导致的临床表型相对温和,而Gly147Asp突变可导致病情进展较快。该结果有待在更多的病例中进行证实。     

一个46,XY"女性"不育症家系的遗传学分析

运用常规的染色体G带分析和基因分析技术对-46,XY男性女性化家系进行遗传学分析,发现：先证者及其妹妹的染色体核型为46,XY,其母亲和父亲的核型正常;对睾丸决定基因（SRY）和雄激素受体基因（AR）进行突变检测,在SRY基因的整个编码区中没有发现突变,而AR基因的第7个外显子的第840个密码子由CGT（编码精氨酸）变为CAT（编码组氨酸）,这一改变可能是导致核型为46,XY女性化而发生不育。     

一例复合杂合性突变所致多发性内分泌腺瘤病1型的临床表现与基因型

目的分析1例多发性内分泌腺瘤病1型(MEN1)患者的临床特征和基因型,以期提高临床医生对本病的认识与诊断的准确性。方法分析患者病史、临床表现、实验室检查及影像学资料,并对MEN1基因进行扩增与测序。结果发现1例临床症状符合典型的多发性内分泌腺瘤病1型患者,基因测序鉴定本例患者的MEN1基因第9号外显子内存在同义突变,为c.1818位T→C(rs540012),第10号外显子存在两处复合杂合性突变,分别是c.2098位C→T(R527X,rs104894261),造成第527位氨基酸精氨酸(CGA)突变为终止密码子TGA;和c.2140位G→A(A541T,rs2959656),造成第541位丙氨酸(GCA)突变为苏氨酸(ACA)。结论本例患者表现了典型的多发性内分泌腺瘤病1型的临床症状与体征,遗传学分析进一步验证了患者携带MEN1基因的致病突变,提示根据临床表现结合基因学确诊本病的可靠性。     

一VHL 家系致病基因突变的检测与分析*

目的:研究中枢神经系统血管母细胞瘤(VHL)基因突变的主要类型和发生情况,探讨VHL疾病发生的原因、临床特点等。方法:以基因组DNA为模板,PCR扩增VHL基因3个外显子及5’UTR区域,结合DNA直接测序的方法,对一个有多个小脑血管母细胞瘤患者的家系进行VHL基因突变检测。结果:发现该家系VHL基因5’UTR区、外显子1和外显子2正常,外显子3存在c.499C>G的改变,为一个错意突变,氨基酸改变为Arg-Gln(p.R167Q),该突变是导致这个家系的患者发病的直接原因。结论:VHL疾病的突变主要集中在VHL蛋白的α、β结构域,位于α结构域的p.R167Q突变为该VHL家系致病的主要原因。     

高坡猪PRKAA1基因多态性检测及生物信息学分析

为了对PRKAA1基因的遗传机理进行更进一步的研究,本试验以高坡猪为研究对象,利用PCR技术对PRKAA1基因的全部外显子进行克隆扩增,并对扩增产物进行正反向直接测序,运用生物信息软件进行序列分析;结果表明,仅在第7外显子75 bp处发现了A/G 1个单核苷酸突变位点,且该位点突变导致氨基酸密码子由CAA变为CAG,所对应编码的氨基酸也由谷酰胺酸(Gln)变为精氨酸(Arg),由于氨基酸的改变导致了PRKAA1基因的mRNA二级结构和蛋白质三级结构发生了构象改变。突变前后该蛋白分子量分别为136.152 k D和136.166 k D,PRKAA1蛋白无跨膜结构,不属于分泌蛋白。本研究结果可为高坡猪的PRKAA1基因表达载体的构建提供依据。     

野猪、家猪及野家杂种猪Leptin基因2、3外显子的SNPs分析

Leptin是一种内分泌激素（167个氨基酸）,主要在脂肪组织中表达,通过下丘脑对机体内能量的消耗和摄取起着重要的调节作用^[1]。鉴于此本文对野猪、家猪及野家杂种猪Leptin的2、3外显子进行了SNPs分析,并检测到了多态性。对纯合子片段进行克隆和测序,结果表明在编码区的214位碱基由T突变为C,编码的氨基酸没有发生改变;364位碱基由C突变为G,365位碱基由G突变为C,编码的Arg转变为Ala;426位由G突变为A,编码的氨基酸没有发生改变;451位插入碱基T,造成移码突变;462位由G突变为T。     

中国荷斯坦牛ABCG2基因编码区多态性检测及生物信息学分析

目的：研究中国荷斯坦牛ABCG2基因编码区（CDS）多态性,并进行生物信息学分析。方法：以中国荷斯坦牛为材料,利用PCR-SSCP技术对ABCG2基因CDS多态性进行检测,然后预测蛋白质序列的改变,并用生物信息学软件对蛋白质序列突变前后的结构及性质进行分析。结果：在外显子9中存在一个A→G碱基突变,导致氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸,将此突变命名为Y367C;在外显子14中存在一个G→A突变,导致氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺,将此突变命名为R578Q。2个突变一个位于功能区与跨膜区之间,一个位于跨膜区。生物信息学分析发现,蛋白质二级结构增加了1个卷曲（C）和2个转角（T）,同时减少了3个β折叠（E）,且ABCG2蛋白的组成和一些性质也发生了改变。结论：检测到的2个单核苷酸多态性引起了ABCG2蛋白性质和二级结构的改变;为进一步研究ABCG2蛋白对产乳性状的影响奠定了基础。     

甘肃肉羊新品种选育群GDF9基因外显子2多态性及其与产羔性状关联分析

根据GenBank发布的绵羊GDF9基因外显子2的序列设计4对引物,采用PCR-SSCP技术分析GDF9基因外显子2在甘肃内羊新品种选育群羊中的单核苷酸多态性,并与产羔性状进行关联分析.结果表明,GDF9基因的扩增片段在所检测的新品种群羊中存在PCR-SSCP多态性,检测到3种基因型(AA、AB和BB),而在32只无角陶赛特母羊群中只检测到AA和AB基因型.测序结果显示,GDF9基因编码区第978位碱基发生A→G突变,但没有导致氨基酸的改变;第994位碱基发生G→A突变,导致Ⅴ变成Ⅰ(缬氨酸→异亮氨酸).新品种选育群羊产羔数的最小二乘均值关系为AB＞ AA＞ BB,统计分析结果初步表明3种基因型之间差异不显著(P＞0.05).故该区域可能不是影响新品种群羊繁殖力的功能结构区城.