植入前遗传学诊断的原理、方法及适应症

植入前遗传学诊断是一种非常早的产前诊断,指在胚胎着床之前即对配子或胚胎的遗传物质进行分析,检测配子或胚胎是否有遗传物质异常,选择正常胚胎进行移植。与传统的产前诊断相比,能避免选择性流产异常妊娠给妇女带来的心身痛苦。本文就该领域的发展及现状和其诊断原理、方法及适应症进行了总结和综述。 Abstract:Preimplatation genetic diagnosis (PGD) is a very early form of prenatal diagnosis.Gametes or embryos are biopsied and a genetic diagnosis is carried out on the biopsied cells to investigate if the gametes or embryos is free of genetic disease.And the normal embryos is transferred to the mother.Comparing to the traditional prenatal diagnosis,PGD is a method that can avoid aborting a abnormal pregnant and reduce pains of women.In this review,we introduce the history of development and statues in quo,principle,method and application of PGD.     

一VHL 家系致病基因突变的检测与分析*

目的:研究中枢神经系统血管母细胞瘤(VHL)基因突变的主要类型和发生情况,探讨VHL疾病发生的原因、临床特点等。方法:以基因组DNA为模板,PCR扩增VHL基因3个外显子及5’UTR区域,结合DNA直接测序的方法,对一个有多个小脑血管母细胞瘤患者的家系进行VHL基因突变检测。结果:发现该家系VHL基因5’UTR区、外显子1和外显子2正常,外显子3存在c.499C>G的改变,为一个错意突变,氨基酸改变为Arg-Gln(p.R167Q),该突变是导致这个家系的患者发病的直接原因。结论:VHL疾病的突变主要集中在VHL蛋白的α、β结构域,位于α结构域的p.R167Q突变为该VHL家系致病的主要原因。     

FSHR、LHR基因突变与多态对女性生殖的影响

卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素(LH)促进性腺的发育和成熟、调节人类配子的产生,在生殖方面起着关键的作用。两受体(FSHR与LHR)的突变会导致生殖能力的改变,出现一系列临床症状,引起组织学,分子水平等多方面的变化,同时FSHR的多态性与卵巢反应性、女性的月经周期等许多方面相关。本文从多方面阐述FSHR与LHR对女性生殖的影响。     

小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1的克隆

从已获得的运用抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)分离、克隆和筛选代表8-细胞早期胚胎和紧密化8-细胞胚胎差别表达基因的ESTs片段(GenBank登录号：BQ740263、BQ740251)入手,经比较二者的同源性发现这两个EST末端反向互补,拼接成一个cDNA片段,经分析此序列包含一个完整的阅读框,提交给GenBank,登录号为AY134859。根据此序列设计引物从小鼠8-细胞紧密化胚胎cDNA中经PCR扩增出目的片段,克隆入pUCm—T载体后测序而获得全长cDNA,为小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1,分析比较证明Crg1基因与AY134859基本吻合。Crg1基因的cDNA全长为810bp,只有一个外显子,编码由150个氨基酸组成,分子量理论值为17．67kD的蛋白质。与最新的小鼠基因组工作草图进行电子杂交,该基因被定位在小鼠的14号染色体上。RT—PCR实验证明在小鼠植入前各个时期的胚胎、小鼠胚胎干细胞中均有表达,在小鼠胚胎成纤维细胞中没有表达。半定量RT—PCR实验证明Crg1基因在紧密化胚胎中表达较8—细胞胚胎高。采用Northern—blot手段分析Crg1基因在成年小鼠的8种组织中的表达情况,结果表明该基因只在小鼠卵巢中有微弱的表达,转录本大小为1．2kh,而在成年小鼠的脑、心脏、肾、睾丸、肝脏、肺、脾等中没有表达。研究表明,Crg1基因可能与小鼠胚胎紧密化及保持细胞的全能性相关。     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA。进而运用抑制消减杂交技术（SSH）对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个cDNA片段为新的EST,提交GeneBank后被接受并给予了新序列编号。这17个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础。通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失。Abstract: A total of 181 8-cell embryos and 241 8-cell compacted embryos were collected respectively from Kunmingbai mouse and their cDNA was synthesized directly using SMART PCR. Genes, which expressed differently between early 8-cell embryos and 8-cell compacted embryos, were investigated using the method of suppression subtractive hybridization (SSH). Then PCR production was cloned into pUCm-T vector respectively according to the size after isolated and purified. Twenty-seven ESTs (expressed sequence tags ) of genes expressed differently between early 8-cell embryos and 8-cell compacted embryos have been isolated and cloned. seventeen of those were novel ESTs after being confirmed by blaster matching in GenBank for homology analysis. And they were banked into GenBank with accession numbers. All 17 ESTs might be for novel genes related to compaction in compacted embryos. And longer ESTs may be obtained by cloning according to the size.     

运用PCR对小鼠植入前胚胎进行性别诊断

根据C57BL6小鼠Y染色体重复序列145C5的碱基顺序,设计并合成一对引物,运用PCR扩增昆明白小鼠入前胚胎卵裂球DNA,以确定其性别,共对108枚活检胚胎的相应卵裂球进行了性别诊断,获雄性胚46枚,雌性胚62枚,移植后分别获雄性仔鼠4只,准确率100％（4／4）,雌性仔鼠9只,准确率70％（9／13）,本研究结果表明小鼠Y染色体重复序列145C5的碱基顺序在C57BL6小鼠和昆明白小鼠中基本一致,为农牧业动物进行性别选择和运用PCR进行单基因病植入前遗传学诊断提供了方法学基础。     

小鼠胚胎紧密化现象分子基础的研究进展

就小鼠植入前胚胎紧密化过程中胚胎的形态变化、细胞极化、细胞间连接及紧密化的物质基础、时控机制等作了综述.对紧密化现象的分子基础研究大多数都集中在翻译后水平的调控,而在基因水平的研究较少.     

13例肝豆状核变性家系致病基因突变的检测和分析

为了研究Wilson病(wilson disease,WD)基因突变的类型和发生情况,探讨WD疾病的病因、临床特点,通过采用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)方法结合DNA测序方法对13例无亲缘关系的患者及33住亲属进行A TP7B基因所有外显子及5'端非转录区突变检测.33例DNA标本确认11种基因突变,其中包括9种错义突变(p.R778L、p.R919G、p.T1178A、p.T977M、p.K1010Q、p.C490TERM、p.A874P、p.G943S、p.G943D),1种缺失突变(2790delCAT),1种剪切位点改变(c.1708-1G＞C (intron 4 +1 G＞C)).在13个家系中,发现4例R778L突变,2例2790delCAT,均为杂合型突变,涉及17个等位基因,本组检出率为70.8％(17/24).DHPLC-测序法是WD疾病基因突变筛查较为快捷、全面而且敏感的方法.WD基因突变存在热点区分别为3、8、12号外显子.2790delCAT、p.K1010Q、c.1708-1G＞C (intron 4+1 G＞C)是ATP7B基因新突变类型,p.S406A、p.V456L、p.V 1140A、p.R952K是中国人比较常见的多态类型.     

多重连接依赖性探针扩增技术及其应用进展

多重连接依赖性探针扩增(MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和相对定量分析的新技术。该技术具有分辨率高、操作简便、设备要求低等诸多优势而广泛用于检测人类基因组内拷贝数变异(CNV)。近年来,MLPA在技术与应用上又有许多新的发展,如运用化学合成法制备3'、5'探针,MLPA在基因甲基化检测、基因表达水平分析、基因部分片段重复区域拷贝数分析及转基因基因分型中的应用,并且MLPA与基因芯片微阵列技术的结合,使得多重连接探针扩增真正具备了高通量检测能力。本文就MLPA技术及其应用进展作一综述。