怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

齿裂菌属和皮下盘菌属ISSR-PCR最佳反应条件的研究

在利用ISSR技术分析齿裂菌属和皮下盘菌属遗传多样性的研究中,为获得条带清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的条件进行了筛选,确定了此类菌物ISSR-PCR反应的最适宜条件:在15μLPCR反应体系中,10倍Taq酶缓冲液1.5μL,DNA模板8ng/μL,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.00U,ddH2O9.0μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。     

唐古特大黄ISSR-PCR反应条件的优化

利用单因素试验对影响唐古特大黄ISSR-PCR扩增的重要参数进行优化,以期建立其最佳反应条件。结果如下:20μL反应体系包括1.5×PCR buffer(15mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl),1.00mmol/LMgCl2,0.6UTaq DNA聚合酶,0.125mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物和30ng模板DNA;引物UBC888适宜的退火温度为57.4℃。ISSR反应条件的建立为利用分子标记技术研究唐古特大黄居群遗传多样性奠定了良好基础。     

Identification of mosquito bloodmeals using mitochondrial cytochrome oxidase subunit I and cytochrome b gene sequences

Abstract.  Primer pairs were designed and protocols developed to selectively amplify segments of vertebrate mitochondrial cytochrome oxidase subunit 1 (COI) and cytochrome b (Cyt b ) mtDNA from the bloodmeals of mosquitoes (Diptera: Culicidae). The protocols use two pairs of nested COI primers and one pair of Cyt b primers to amplify short segments of DNA. Resultant sequences are then compared with sequences in GenBank, using the BLAST function, for putative host identification. Vertebrate DNA was amplified from 88% of our sample of 162 wild-caught, blood-fed mosquitoes from Oregon, U.S.A. and GenBank BLAST searches putatively identified 98% of the amplified sequences, including one amphibian, seven mammalian and 14 avian species. Criteria and caveats for putative identification of bloodmeals are discussed.     

曼地亚红豆杉RAPD反应体系与程序的优化

以曼地亚红豆杉为研究对象,采用L16(45)正交组合实验和单因素梯度实验对MgCl2、dNTP、随机引物、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等影响RAPD扩增的重要因素进行优化,以期建立最优的RAPD反应体系与程序。实验结果表明,各因素最适条件为:25μLPCR反应体系中10×Buffer2.5μL,MgCl21.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,随机引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA80ng;退火温度为37℃,循环次数为45次。     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

美国黑核桃SSR反应体系优化

优化SSR-PCR反应体系是黑核桃（Juglans nigra L.）SSR基因鉴定和群体遗传等研究的基础。本研究通过对PCR反应中Mg²⁺浓度、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA量的组合以及PCR程序组合试验,确定了黑核桃SSR的最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）,0.25 mmol·L^-1 dNTPs,1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺ 1 μL 10X Taq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,1.0 mmol·L^-1单对引物（0.5 mmol·L^-13对引物）。SSR-PCR反应扩增程序为：94℃变性3 min;93℃变性15 s,50℃或者53.5℃退火1 min,72℃延伸30 s,32个循环;72℃后延伸10 min,置4℃保存。利用此反应体系对黑核桃进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,适合进一步对黑核桃群体遗传、基因型鉴定和分子生态研究。     

12S rRNA和Cyt b基因序列测定在獐乳制品鉴定中的应用

采用改良的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法从脂肪含量很高的动物乳制品及胃组织中提取出基因组总DNA,利用特异引物扩增了线粒体12S rRNA基因和Cyt b基因的部分片段,测定了12S rRNA和Cyt b基因的PCR扩增产物序列,使用BLAST搜索软件将其序列与GenBank中的同源序列进行比对,并利用DNAMAN分析软件分析序列同源性。结果表明3件检材均来源于獐Hydropotes inermis。本研究所用方法在野生动物乳制品鉴定中具有较高的应用价值。     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计L9(34)对影响葡萄ISSR-PCR反应体系的4个因素(dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA)在3个浓度水平上进行试验,并通过直观分析初步确定其反应体系;在此基础上,通过单因素试验探讨了dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄ISSR-PCR扩增结果的影响,确定最佳反应水平。最终建立了葡萄ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:在25μL的反应体系中,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量0.5 U,引物浓度0.4mmol/L,DNA模板用量40 ng。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min 30 s,40次循环;最后72℃延伸10 min,10℃保存。     

云锦杜鹃ISSR扩增条件的优化

以云锦杜鹃基因组DNA为研究对象,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,包括镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、BSA浓度、引物用量以及退火温度等进行筛选和优化,建立了稳定、可重复的最佳反应体系:10μLPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/LTris.HClpH9.0,50mmol/LKCl,0.1%TritonX-100),1.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTP,0.45UTaqDNA聚合酶,2mg/mLBSA,12pmol引物,16ng模板DNA。利用所建立的优化反应体系从100个ISSR引物中共筛选出12个稳定性好、重复性高的引物,对5个居群共100个云锦杜鹃个体的DNA进行扩增,检测到170个位点,其中多态位点150个,多态位点百分率88.24%,5个居群的多态位点百分率平均为48.23%。云锦杜鹃ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究云锦杜鹃的遗传多样性奠定了良好的基础。     

拟南芥SSR检测体系的优化

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗为实验材料,采用单因素筛选法及L16(45)正交实验方法,对简单序列重复(SSR)技术中聚合酶链式反应(PCR)组分、扩增程序、电泳检测等环节进行优化。优化25μl反应体系为:1×PCR Buffer、20ng模板DNA、1.5mmol.L-1Mg2+、0.3μmol·L-1引物、150μmol·L-1dNTPs和1.0U Taq DNA聚合酶。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,共30个循环,72℃延伸10min。用非变性聚丙烯酰胺凝胶(EB染色)电泳检测并取得较好效果。利用该体系进行扩增,所得谱带清晰、稳定、非特异性带少。     

云南松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜云南松SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用近缘种火炬松的引物,采用正交设计L16(45)对云南松SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了适于云南松的SSR反应体系.在10μL的反应体系中,模板DNA的用量为30.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为1.0 U,Mg2+的浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物的浓度为0.2 μmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,48℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延长10 min,4℃保存.最后利用1个居群对该体系进行稳定性验证,结果可用于云南松SSR标记的研究.     

冬瓜和节瓜DNA提取及RAPD反应体系优化

以8份冬瓜和节瓜为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,采用正交试验设计,对冬瓜和节瓜RAPD条件进行了优化,建立了最佳反应体系:25μL反应体系中含1×buffer,模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶的浓度分别为20 ng、2.0mmol/L、0.24 mmol/L、0.3μmol/L和1.0 U。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,36.9℃退火45 s,72℃延伸1.5min,共40个循环;72℃延伸10 min,12℃保存。     

利用正交设计优化异色瓢虫SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验,试验结果用DPS和MINITAB软件进行分析,建立了异色瓢虫SRAP-PCR反应的最佳体系,即在20μL体系中模板50~100ng、引物0.25μmol/L、dNTPs0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U、Mg2+0.375~0.625mmol/L。并对反应体系进行梯度退火试验,得到最佳退火温度为50.3℃。这一优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行瓢虫遗传图谱的构建、多态性分析和基因定位奠定了技术基础。     

Performance comparison of genetic markers for high‐throughput sequencing‐based biodiversity assessment in complex communities

Metabarcode surveys of DNA extracted from environmental samples are increasingly popular for biodiversity assessment in natural communities. Such surveys rely heavily on robust genetic markers. Therefore, analysis of PCR efficiency and subsequent biodiversity estimation for different types of genetic markers and their corresponding primers is important. Here, we test the PCR efficiency and biodiversity recovery potential of three commonly used genetic markers – nuclear small subunit ribosomal DNA (18S), mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) and 16S ribosomal RNA (mt16S) – using 454 pyrosequencing of a zooplankton community collected from Hamilton Harbour, Ontario. We found that biodiversity detection power and PCR efficiency varied widely among these markers. All tested primers for COI failed to provide high‐quality PCR products for pyrosequencing, but newly designed primers for 18S and 16S passed all tests. Furthermore, multiple analyses based on large‐scale pyrosequencing (i.e. 1/2 PicoTiter plate for each marker) showed that primers for 18S recover more (38 orders) groups than 16S (10 orders) across all taxa, and four vs. two orders and nine vs. six families for Crustacea. Our results showed that 18S, using newly designed primers, is an efficient and powerful tool for profiling biodiversity in largely unexplored communities, especially when amplification difficulties exist for mitochondrial markers such as COI. Universal primers for higher resolution markers such as COI are still needed to address the possible low resolution of 18S for species‐level identification.     

海南龙血树RAPD-PCR反应体系的优化

采用单因子试验和正交试验设计,对影响海南龙血树RAPD-PCR反应的模板DNA量、Mg2+、dNTP和引物浓度,Taq聚合酶用量等因子进行研究,分析各因子对RAPD-PCR扩增结果的影响,确立了海南龙血树RAPD-PCR反应的最佳条件,即在25 μL反应体系中,包含10×buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L...     

New mitochondrial primers for metabarcoding of insects,designed and evaluated using in silico methods

Insect metabarcoding has been mainly based on PCR amplification of short fragments within the “barcoding region” of the gene cytochrome oxidase I (COI). However, because of the variability of this gene, it has been difficult to design good universal PCR primers. Most primers used today are associated with gaps in the taxonomic coverage or amplification biases that make the results less reliable and impede the detection of species that are present in the sample. We identify new primers for insect metabarcoding using computational approaches (ecoprimers and degeprime ) applied to the most comprehensive reference databases of mitochondrial genomes of Hexapoda assembled to date. New primers are evaluated in silico against previously published primers in terms of taxonomic coverage and resolution of the corresponding amplicons. For the latter criterion, we propose a new index, exclusive taxonomic resolution, which is a more biologically meaningful measure than the standard index used today. Our results show that the best markers are found in the ribosomal RNA genes (12S and 16S); they resolve about 90% of the genetically distinct species in the reference database. Some markers in protein‐coding genes provide similar performance but only at much higher levels of primer degeneracy. Combining two of the best individual markers improves the effective taxonomic resolution with up to 10%. The resolution is strongly dependent on insect taxon: COI primers detect 40% of Hymenoptera, while 12S primers detect 12% of Collembola. Our results indicate that amplicon‐based metabarcoding of insect samples can be improved by choosing other primers than those commonly used today.