应用降落PCR和正交设计优化AtSUC9 PCR反应体系

目的:建立最适的AtSUC9 PCR反应体系。方法:应用降落PCR和正交设计,从Mg2 、dNTPs、引物、甘油4种因素3个水平,对拟南芥AtSUC99 PCR反应体系进行优化。结果:确立了适合拟南芥AtSUC99 PCR反应体系:在20μl反应体系中,含模板1μg,引物(20μmol/L)0.5μl,dNTPs(10mmol/L)0.3μl,10×PCRbuffer2μl,Mg2 (25mmol/L)1.2μl,TaqDNAPolymerase1U,甘油10μl。结论:降落PCR和正交设计是一种有效的植物基因PCR体系优化方法。     

散斑壳属真菌RAPD-PCR反应条件的优化

以分离自四川省二郎山林场云南松上的松针散斑壳菌(Lophodermium pinastri)为材料,提取其总基因组DNA做为RAPD-PCR体系优化的模板。研究了dNTPs、Mg~(2+)、DNA模板、Taq酶、引物等组分对RAPD反应结果的影响,并建立了最佳反应体系:25μL PCR反应体积,10×Taq酶缓冲液2．5μL,1．5 U Taq酶,20 ng DNA模板,0．4 mmol/L dNTPs,4．0 mmol/L Mg~(2+),0．48μmol/L引物,10．2μL ddH_2O。     

南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化

[目的]建立适合南药益智的扩增片段长度多态性(AFLP)扩增体系来研究不同地理居群益智遗传多样性。[方法]利用植物基因组试剂盒法提取高质量的益智基因组DNA,采用单因素和正交试验对AFLP过程中的酶切和PCR相关影响因素进行优化,并对适合益智AFLP分析的引物组合进行筛选。[结果]实验结果表明最佳酶切反应体系:模板DNA 0.6μg,酶量20 U,酶切时间2 h;最佳AFLP-PCR选择性扩增反应体系(总体积为25μL):10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL,d NTPs 2μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,引物(10 pmol/μL)各2.0μL,Taq酶(5 U/ml)0.5μL,模板稀释25倍2μL。利用建立的最佳扩增体系从64对引物中筛选获得8对选择性引物适合益智AFLP分析。[结论]建立了稳定的AFLP-PCR体系,为研究益智遗传多样性的AFLP分析奠定了基础。     

大苞萱草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验。正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了大苞萱草ISSR-PCR的最佳反应体系。在20μL的反应体系中:Taq酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP0.20 mmol/L,引物0.4μmol/L,1×PCR buffer,30 ng模板DNA。在此基础上筛选出10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。     

野生毛木耳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为获得条带清晰,重复性好,多态性高的野生毛木耳ISSR扩增结果,通过单因子试验对ISSR-PCR反应条件进行了优化。确定了ISSR分析的最佳PCR条件:25μL反应体系中模板DNA25ng、dNTPs0.24mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+0.9mmol/L、引物2μmol/L、10×PCR buffer2.5μL、ddH2O12.6μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。在此基础上初步筛选出25条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行野生毛木耳种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个适合的程序。     

均匀设计优化毛竹EST-SSR PCR反应体系

本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10(54)表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为:10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2+、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。     

花椒ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因子试验和正交设计2种方法对影响花椒ISSR-PCR反应体系的4个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTP、引物）在3个水平上进行优化试验。选用L9（34）正交设计方案,从电泳结果中直观获得影响因素的最佳组合。单因子试验分别研究各影响因素不同含量对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。结果表明,适宜花椒ISSR-PCR反应的最佳体系为：20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2＋2.0 mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,引物1.0μmol/L,10×PCR buffer2.5μL,50 ng模板DNA,53℃退火,35个循环。     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立大帽藓科ISSR-PCR实验最佳反应体系。[方法]提取大帽藓科的基因组DNA,利用5因素4水平的正交设计实验方法对大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系进行最佳反应体系的筛选。[结果]大帽藓科植物ISSRPCR的最佳反应体系为(20μL):即20μL体系中,PCR Buffer 2. 0μL、Mg2+2. 25 mmol/L,d NTP 0. 2 mmol/L,引物0.65μmol/L,Taq DNA聚合酶0. 7 U,模板DNA 10 ng。5个因素对该反应体系的影响顺序为:Mg2+引物 d NTP Taq DNA聚合酶模板DNA。利用该体系,在UBC808等13种引物中进行验证,均能得到有效的扩增条带。[结论]通过对大帽藓科基因组DNA的提取及体系优化,获得了大帽藓科植物最佳反应体系,为后续应用ISSR技术鉴定大帽藓科种质资源以及遗传多样性研究奠定了基础。     

四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系中的4种主要因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,PCR结果用统计软件SPSS16.0分析。结果显示,Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP这3因素的不同水平对PCR反应结果都有显著影响,其中Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙菜ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为3.0 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,0.6μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶,40 ngDNA,2.5μL10×buffer。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术基础。     

蚬壳花椒ISSR-PCR反应体系的建立及优化

通过单因素试验及正交设计方法对影响蚬壳花椒ISSR-PCR扩增的主要因素(模板DNA、Mg2+的浓度、引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化,以建立蚬壳花椒ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:最佳反应体系(20μL)为模板DNA 60ng、MgCl2 2.5mmol/L、dNTPs 0.15mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶2.4U。在此基础上,从100条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性好的ISSR引物并经过10份蚬壳花椒种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点。该反应体系的建立为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。     

岩白菜ISSR-PCR反应体系的优化

目的:优化岩白菜ISSR-PCR反应体系,为利用ISSR标记进行岩白菜遗传多样性研究服务。方法:采用5因子4水平正交设计法优化岩白菜ISSR-PCR反应体系。结果:五个因子从大到小的影响力排序结果为:dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物=Taq酶。岩白菜ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积25μL,内含10×PCR缓冲液2.5μL、2.5 mmol.L-1Mg2+、2.0 U Taq酶、0.2 mmol.L-1dNTPs、0.48μmol.L-1ISSR引物、125 ng模板DNA。结论:研究获得的最佳反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,为利用ISSR标记技术研究岩白菜遗传多样性奠定了基础。     

齿裂菌属和皮下盘菌属ISSR-PCR最佳反应条件的研究

在利用ISSR技术分析齿裂菌属和皮下盘菌属遗传多样性的研究中,为获得条带清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的条件进行了筛选,确定了此类菌物ISSR-PCR反应的最适宜条件:在15μLPCR反应体系中,10倍Taq酶缓冲液1.5μL,DNA模板8ng/μL,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.00U,ddH2O9.0μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。     

狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）ISSR-PCR反应体系的建立与优化

研究目的是获得适用于狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）遗传多样性研究的ISSR—PCR反应标准化程序。通过单因素试验设计,对Mg^2＋、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板、引物浓度,以及退火温度、循环次数等影响ISSR扩增的主要因素进行了研究和优化。结果表明,UBC808、UBC811、UBC812、UBC825、UBC826、UBC841、UBC888及UBC891引物适用于该研究;20μL ISSR—PCR最适反应体系包括：6ngDNA模板、0．4μmol／L引物、2．25mmoL／LMg^2＋、0．6U Taq DNA聚合酶、0．4mmol／LdNTPs。扩增程序为：94℃预变性4min;然后94℃变性1min,48～50℃（根据不同引物确定）复性2min,72℃延伸1min,共进行40个循环;最后,72℃延伸7min,4℃保存。     

獐ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选

利用正交试验L₁₆(4⁵)对影响獐(Hydropotes inermis)ISSR-PCR反应的Taq DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度及模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行优化,同时对退火温度进行梯度PCR反应,以建立适合于獐ISSR-PCR反应的最佳体系.最终确定獐25μL ISSR-PCR反应体系为:Taq酶1.25 U·25μL^-1、Mg²⁺浓度2.5 mmol·L^-1、引物浓度0.3μmol·L^-1、DNA模板量350 ng·25μL^-1、dNTP浓度0.15 mmol·L^-1.在此基础上,利用优化的反应体系成功筛选出10条用于獐相关研究的ISSR引物并确定了各自的最佳退火温度,为今后利用ISSR技术进行獐的物种鉴定与分类、亲缘关系、系统发育和生理病理学研究奠定了技术基础,也为开展其它大型资源动物如黑麂的保护遗传学研究提供理论基础.     

唐古特大黄ISSR-PCR反应条件的优化

利用单因素试验对影响唐古特大黄ISSR-PCR扩增的重要参数进行优化,以期建立其最佳反应条件。结果如下:20μL反应体系包括1.5×PCR buffer(15mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl),1.00mmol/LMgCl2,0.6UTaq DNA聚合酶,0.125mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物和30ng模板DNA;引物UBC888适宜的退火温度为57.4℃。ISSR反应条件的建立为利用分子标记技术研究唐古特大黄居群遗传多样性奠定了良好基础。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。     

黄鳝ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

以黄鳝基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化.建立了黄鳝的最适ISSR-PCR反应体系,25 μl反应体系中含2.5 mmol/ L Mg2+,250 μmol/ L dNTPs,0.25 μmol/ L 引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,30 ng DNA模板.最佳反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,48～57℃复性40 s(随引物而确定),72℃延伸1.5 min,循环次数40;72℃延伸10 min.利用所建立的ISSR反应体系,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带.     

番茄叶霉病菌ISSR-PCR体系的建立

以番茄叶霉病菌(Passalora fulva)基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交设计试验对该菌ISSR-PCR体系中的一些重要参数(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、缓冲液、循环次数)和引物进行筛选和优化,并对退火温度进行了梯度优化,建立了番茄叶霉病菌ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物1.5μmol/L,模板DNA45 ng,TaqDNA聚合酶1.0 U,1倍的PCR缓冲液,循环40次,退火温度50℃。     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。