番茄斑萎病毒GN与西花蓟马互作蛋白的初步筛选

[目的]西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)的主要传播媒介,以循环增殖方式传播TSWV,但在传播过程中参与的互作蛋白尚不清楚。本研究以TSWV的外鞘糖蛋白GN (GlycoproteinN)为诱饵筛选与西花蓟马互作的蛋白,为阐明TSWV与西花蓟马的互作机制提供依据。[方法]构建以pPR3-N为载体的西花蓟马泛素分裂酵母双杂交膜系统cDNA文库,利用Gene Ontology (GO)通路注释互作蛋白,分析其生物学功能。[结果]西花蓟马cDNA文库库容为3.2×10~6,除去重复序列、载体序列和移码序列,筛选到74个与G_N互作的蛋白,参与了细胞过程、代谢过程、生物调节过程等12种生物过程。[结论]成功构建了西花蓟马酵母双杂交膜体系cDNA文库,筛选到与TSWV GN互作的蛋白,为进一步研究TSWV与西花蓟马的互作机制奠定了基础。     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内和体外证实了TZSV NSs和西花蓟马VDAC存在特异性互作。这些结果有助于揭示西花蓟马VDAC蛋白调控西花蓟马持久传毒的机制,为虫传病毒病的防治提供理论基础。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

寄主植物接种番茄斑萎病毒对西花蓟马种群的影响

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是一种入侵我国的重要害虫, 而番茄斑萎病毒是以西花蓟马传播为主的一种极具危害性的世界性病毒, 通过研究西花蓟马与番茄斑萎病毒之间的互作将有助于进一步深入理解西花蓟马以及番茄斑萎病毒的发生与猖獗机制, 同时也将为制定合理、可持续的控制西花蓟马及其传播的植物病毒防控策略提供理论依据。【方法】利用应用特定年龄-龄期及两性生命表方法, 研究了西花蓟马在辣椒3种处理（健康CK、机械损伤MD、机械接种番茄斑萎病毒MI）叶片上的生长发育、存活及种群增长。【结果】健康、机械损伤和机械接毒叶片上的发育历期依次为12.45, 11.97和11.18 d。雌雄成虫寿命和雌虫产卵量在不同处理植株叶片上差异显著(P<0.05), 在机械接毒叶片上寿命最长(雌13.51 d, 雄12.69 d); 繁殖能力最强, 产子代数高达33.01头1龄若虫/雌。健康、机械损伤和机械接毒叶片上西花蓟马内禀增长率分别为-0.009, 0.153和0.190 d-1, 净生殖率依次为0.84, 14.54和21.79。【结论】番茄斑萎病毒诱导寄主植物辣椒反应使西花蓟马发育历期缩短, 成虫寿命延长, 繁殖能力提高, 种群增长加速。     

镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了研究蛋白质之间的相互作用,利用Gateway技术构建了镜鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)骨骼肌酵母双杂交cDNA文库.经检测表明,构建的初级cDNA文库的库容量为8×106CFU;酵母双杂交cDNA文库的库容量为6.64×106CFU,插入片段集中在1-2 kb之间,具有较好的多态性.随机挑取的24个克隆没有空载体,全部发生了重组.较高的库容量、较长的插入片段以及较高的重组率保证了文库的完整性和覆盖度.镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究影响骨骼肌发育的信号传导通路奠定了基础.     

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308。从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库。应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用。结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。     

两个水稻品种（系）酵母双杂交cDNA文库的构建和比较分析

"武育粳3号"和"KT95-418"为两个遗传背景基本一致而对水稻条纹叶枯病表现为明显抗性差异的粳稻(Oryza sativa L.ssp. japonica)品种(系).利用SMART技术合成双链cDNA后,通过SfiⅠ酶切位点将cDNA片段定向插入到改造的载体NpGADT7中,构建了两品种(系)水稻的酵母双杂交cDNA文库.检测结果表明:所构建的两个文库库容量均大于1.0×106 cfu;初始文库滴度分别为1.0×1010 cfu/mL和5.0×1010 cfu/mL,扩增文库滴度均为1.0×1011 cfu/mL;两文库重组率均大于95 %;"武育粳3号"文库cDNA插入片段长度集中分布在700 bp～800 bp之间,"KT95-418"集中分布在750 bp～1 000 bp之间;小规模测序结果表明两文库中全长基因的比例均超过60 %.两品种(系)水稻酵母双杂交cDNA文库的构建为筛选分离抗病相关的变异基因及开展寄主与水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)互作的研究奠定了基础.     

灰飞虱高带毒（RSV）群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）互作机制, 本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料, 分离纯化mRNA, 反转录合成双链cDNA, 并连接三框型接头, 层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库, 再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上, 构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明： 文库库容量为3.68×10⁷ cfu, 扩增文库滴度为2.62×10¹⁰ cfu/mL; 文库重组率大于95%, cDNA插入片段平均长度>1 kb, 达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。     

SPF鸡肝脏细胞cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化进酵母Y187感受态,以同源重组的方式在酵母细胞内构建鸡肝脏酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,成功构建含有1.70×10~7个重组子的SPF鸡肝脏细胞cDNA文库,插入片段多数在0.4~2.0 kb之间,重组率达100%,重组子中平均插入的片段长度为1.0 kb,文库滴度为1.30×10~7 cfu/mL。结果表明,该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为进一步筛选此文库与ARV相互作用的宿主蛋白以及研究其功能提供了数据依据。     

利用酵母双杂交系统筛选雷竹SOC1相互作用蛋白

在雷竹(Phyllostachys violascens)中找到SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)在开花途径中的作用靶标,进一步探索SOC1的作用机制。构建pGBKT7-Pv SOC1诱饵表达载体,通过SMART技术构建开花时期的雷竹cDNA文库,酵母双杂交筛选与SOC1互作的蛋白,并对其进行分析鉴定。结果显示,成功构建了可用于酵母双杂交的cDNA文库,文库的转化率为每微克pGADT7-Rec 3.0×10~6转化子,文库滴度为7.5×10~6 cfu/m L,插入片段主要在250-2 000 bp之间。通过酵母双杂交实验得到与诱饵蛋白PvSOC1相互作用的蛋白,筛选到的靶标蛋白经鉴定是一个富含亮氨酸的蛋白激酶,特征氨基酸序列在不同物种中非常保守,与水稻中的同源蛋白亲缘性最高。     

SMART技术构建衣藻细胞的酵母双杂交文库

衣藻是用来研究植物光合作用和动物纤毛常用的模式生物.为了研究蛋白质之间的相互作用,利用SMART技术构建了衣藻的酵母双杂交文库.使用Trizol试剂提取鞭毛再生过程和光周期培养的细胞进入分裂前的衣藻细胞的总RNA,经过Oligotex纯化得到mRNA;应用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,经过CHROMA SPIN TE-400柱子去除短片段的cDNA;cDNA和线性化载体pGADT7-Rec共转化酵母Y187构建酵母双杂交文库.库容达到3.0 × 106CFU,重组率为70％,插入片段平均长度为0.6 kb.以上结果说明该文库质量较好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白互相作用的蛋白质,为寻找蛋白质的作用伴侣打下基础.     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。     

用于酵母双杂交的HL-60细胞ds cDNA文库的构建

目的构建用于酵母双杂交的HL-60细胞ds cDNA文库。方法采用CLONTECH公司提供的SMART技术,提取对数生长期HL-60细胞的总RNA,逆转录生成第一链cDNA,LDPCR合成dscDNA,与pGADT7-Rec共转化酵母菌AH109。结果成功构建了用于酵母双杂交的HL-60细胞ds cDNA文库,AD转化效率为8×10^4cfu／3μg p GADT7-Rec。结论HL-60细胞ds cDNA文库可以充当酵母双杂交系统中的cDNA文库,用于进一步筛选与M—CSF相互作用的非受体靶分子。     

番茄斑萎病毒对多杀菌素抗性西花蓟马发育繁殖和药剂敏感性的影响

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是重要的入侵害虫,是番茄斑萎病毒（TSWV）最有效的传播媒介,TSWV对西花蓟马的生长发育有一定的影响。多杀菌素是防治西花蓟马最有效的药剂之一,但已有田间西花蓟马对多杀菌素产生抗药性的报道。TSWV对抗性西花蓟马是否也有影响及程度如何尚不清楚。本研究通过对此问题进行深入研究,以期为进一步了解TSWV对西花蓟马的影响提供依据。【方法】应用特定年龄-龄期及两性生命表的方法,研究用番茄斑萎病毒处理和未处理的多杀菌素抗性和敏感西花蓟马种群的生物学特性;用叶管药膜法测定不同处理种群对3种药剂（多杀菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和虫螨腈）的敏感性变化。【结果】对于抗性品系,TSWV处理后西花蓟马的发育历期缩短,雌成虫寿命和产卵量略高,但与对照组差异不显著(P＞0.05),内禀增长率（r）和净生殖率（R₀）分别为0.0433 d^-1和2.210,显著高于对照组（分别为0.0356 d^-1和1.972）（P ≤ 0.001）。对于敏感品系,TSWV处理后西花蓟马的发育历期缩短,雌雄成虫寿命均显著延长（P ≤ 0.001）,产卵量也略有提高,R₀为4.125,显著高于对照组（3.979）（P ≤ 0.001）。TSWV处理后敏感和抗性西花蓟马对多杀菌素的敏感性没有发生明显变化,对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和虫螨腈的敏感性显著降低。【结论】番茄斑萎病毒对多杀菌素敏感和抗性西花蓟马均有直接有利影响,病毒处理的西花蓟马发育历期缩短,繁殖能力增强,成虫寿命延长,对药剂的敏感性降低。     

玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。     

紫云英AD-cDNA文库构建及与豆血红蛋白Lb相互作用靶蛋白的筛选

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母AD-cDNA文库。库容量达到1.02×106/3μg pGADT7-RecDNA,插入片段大小1-1.5 kb左右。以紫云英豆血红蛋白基因AsB2510构建诱饵载体pGBKT7-AsB2510,利用酵母双杂交技术,筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。【结果】在含有X-gal的SD四缺培养基上筛选得到26个克隆,经过质粒抽提、PCR鉴定、回转酵母验证获得10个阳性克隆。【结论】对阳性克隆的外源片段进行了测序和同源性分析,发现一个值得深入研究的含有tify domain和Divergent CCT motif的转录调控因子。     

香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit User Manual cDNA合成试剂盒,反转录合成带有目的接头cDNA第一链,通过LD-PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).产物经双酶切后回收,与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化,并进行了鉴定.结果表明:提取的RAN的A260/A280=1.82,表明所提RNA纯度高:双链cDNA文库大于0.2 kb,且弥散较长,成瀑布条带状;根据生长菌落计数,文库含有1.2×106转化子,重组子不同插入片段在0.3～2 kb之间.表明该文库达到建库要求,为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础.此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道.     

asr基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定

为研究asr作用的分子机制,分析该基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白,分别构建诱饵质粒载体和转基因拟南芥cDNA文库,通过转入酵母细胞中,初步的鉴定分析证实成功构建了诱饵质拉载体和拟南芥cDNA文库.构建的酵母双杂交系统为发现asr基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础.