与紫云英转脂蛋白AsE246相互作用靶蛋白的筛选及其基因表达特征

【目的】AsE246是我们首次报道的紫云英根瘤特异表达的非特异性转脂蛋白(nsLTP1:non specificlipid transfer protein 1)编码基因。本实验旨在筛选和鉴定与AsE246相互作用的宿主植物靶蛋白,并分析靶基因在共生和胁迫条件下的表达特征。【方法】利用酵母双杂交技术、小范围杂交技术及实时荧光定量PCR,筛选与AsE246的相互作用蛋白,并定量分析靶基因在结瘤与固氮过程中的时空表达特性。【结果】获取一个阳性克隆,其cDNA序列经Blast分析表明:候选靶蛋白是一个DnaJ-like蛋白,该蛋白相应基因命名为AsDJL1。AsE246与AsDJL1在酵母体内确实相互作用。AsDJL1在固氮根瘤中特异性增强表达,在NaCl胁迫下表达水平显著提高,在(NH4)2SO4胁迫下表达水平显著下降。【结论】本实验是筛选与LTP相互作用蛋白的首次报道。获得了直接的实验证据表明互作基因AsDJL1与AsE246具有高度相似的表达特征和功能,为深入研究二者的相互作用及其在共生固氮和应答环境胁迫中的调控机制,提供了一定的工作基础和理论依据。     

紫云英AD-cDNA文库构建及与豆血红蛋白Lb相互作用靶蛋白的筛选

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母AD-cDNA文库。库容量达到1.02×106/3μg pGADT7-RecDNA,插入片段大小1-1.5 kb左右。以紫云英豆血红蛋白基因AsB2510构建诱饵载体pGBKT7-AsB2510,利用酵母双杂交技术,筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。【结果】在含有X-gal的SD四缺培养基上筛选得到26个克隆,经过质粒抽提、PCR鉴定、回转酵母验证获得10个阳性克隆。【结论】对阳性克隆的外源片段进行了测序和同源性分析,发现一个值得深入研究的含有tify domain和Divergent CCT motif的转录调控因子。