西花蓟马酵母双杂交文库及TSWV膜蛋白诱饵载体的构建

【目的】为筛选西花蓟马Frankliniella occidentalis与番茄斑萎病毒的互作蛋白。【方法】利用MakeYour Own"MatePlate?"Library System构建西花蓟马酵母双杂交初级cDNA文库以及Y187酵母次级文库,利用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System构建TSWV膜蛋白GN及GC诱饵载体。【结果】建立的西花蓟马初级cDNA文库库容为5.6×106 cfu,其插入片段平均长度大于1 000 bp,重组率约为100%。建立的Y187酵母次级文库转化效率为5×106cfu/μg,文库滴度为2.97×108。构建的pGNKT7-GN及pGBKT7-GC诱饵载体能够在Y2HGold酵母菌株中正确表达,无自激活活性且无毒性。【结论】成功构建了西花蓟马酵母双杂交文库以及番茄斑萎病毒膜蛋白诱饵载体,可用于后续筛库实验。     

番茄斑萎病毒GN与西花蓟马互作蛋白的初步筛选

[目的]西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)的主要传播媒介,以循环增殖方式传播TSWV,但在传播过程中参与的互作蛋白尚不清楚。本研究以TSWV的外鞘糖蛋白GN (GlycoproteinN)为诱饵筛选与西花蓟马互作的蛋白,为阐明TSWV与西花蓟马的互作机制提供依据。[方法]构建以pPR3-N为载体的西花蓟马泛素分裂酵母双杂交膜系统cDNA文库,利用Gene Ontology (GO)通路注释互作蛋白,分析其生物学功能。[结果]西花蓟马cDNA文库库容为3.2×10~6,除去重复序列、载体序列和移码序列,筛选到74个与G_N互作的蛋白,参与了细胞过程、代谢过程、生物调节过程等12种生物过程。[结论]成功构建了西花蓟马酵母双杂交膜体系cDNA文库,筛选到与TSWV GN互作的蛋白,为进一步研究TSWV与西花蓟马的互作机制奠定了基础。     

利用酵母双杂交筛选木薯果胶甲酯酶抑制因子MePMEI1的互作蛋白

果胶甲酯酶抑制因子(PMEI)在植物抗逆过程中具有重要作用.为了探究木薯MePMEI1的生物学功能及其在蛋白互作网络中的作用,本研究通过构建诱饵载体pGBKT7-MePMEI1,通过酵母双杂交方法从木薯cDNA文库中筛选MePMEI1的互作蛋白.结果表明,酵母双杂交共筛选出57个阳性克隆,阳性率约为32.6％,测序鉴定出37种含完整开放阅读框(ORF)的候选互作蛋白,包括非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/苏氨酸特异性蛋白激酶、叶绿素a/b结合蛋白、电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC2)、乙二醛酶Glyox-alase-2、氮素调节蛋白、木糖葡萄糖转移酶(TCH4)等,并通过回转验证检验其蛋白互作的真实性.验证结果表明MePMEI1与VDAC2、Glyoxalase-2蛋白具有相互作用.这进一步补充了其蛋白互作网络,为探究MeP-MEI1蛋白的互作网络提供新的依据.     

植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术

蛋白互作在细胞生命活动中发挥关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞学过程,因此研究蛋白互作对理解分子调控网络至关重要。通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须通过体外和体内系统进行验证。Pull-down和Co-IP是验证植物蛋白互作的常用技术。Pull-down被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作;而在植物活体内,利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达蛋白,继而通过Co-IP进行鉴定是目前验证蛋白互作最简单且最有效的方法之一。该文对GST Pull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP技术原理及实验方案进行详细描述,以期为验证植物蛋白互作提供参考。     

紫云英AD-cDNA文库构建及与豆血红蛋白Lb相互作用靶蛋白的筛选

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母AD-cDNA文库。库容量达到1.02×106/3μg pGADT7-RecDNA,插入片段大小1-1.5 kb左右。以紫云英豆血红蛋白基因AsB2510构建诱饵载体pGBKT7-AsB2510,利用酵母双杂交技术,筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。【结果】在含有X-gal的SD四缺培养基上筛选得到26个克隆,经过质粒抽提、PCR鉴定、回转酵母验证获得10个阳性克隆。【结论】对阳性克隆的外源片段进行了测序和同源性分析,发现一个值得深入研究的含有tify domain和Divergent CCT motif的转录调控因子。     

植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术

蛋白互作在细胞生命活动中发挥关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞学过程,因此研究蛋白互作对理解分子调控网络至关重要。通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须通过体外和体内系统进行验证。Pull-down和Co-IP是验证植物蛋白互作的常用技术。Pull-down被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作;而在植物活体内,利用本氏烟草(Nicotianabenthamiana)叶片瞬时表达蛋白,继而通过Co-IP进行鉴定是目前验证蛋白互作最简单且最有效的方法之一。该文对GSTPull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP技术原理及实验方案进行详细描述,以期为验证植物蛋白互作提供参考。     

斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒(EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7)对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5(Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣),MBF2(mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子),polyubiquitin(多聚泛素类蛋白),esr16(ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白)和NEDD8-like(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白)5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。     

西花蓟马化学感受蛋白的cDNA克隆、时空表达分析及组织定位

【目的】研究西花蓟马Frankliniella occidentalis化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在其嗅觉及化学感受系统中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马化学感受蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,使用BLAST进行同源性比较,采用MEGA6的Neighbor-joining法构建了进化树。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测了西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织(触角、头、足、胸、腹)中该基因的表达谱。免疫新西兰大白兔制备了Focc CSP1蛋白抗体,与样品切片中Focc CSP1蛋白以及10 nm胶体金颗粒偶联的羊抗兔二抗反应,经透射电镜观察,对该蛋白在西花蓟马成虫组织中进行免疫定位。【结果】克隆并鉴定了一个西花蓟马化学感受蛋白基因,命名为Focc CSP1(Gen Bank登录号:KM527949)。该基因c DNA序列全长597 bp,完整开放阅读框(ORF)288 bp,编码95个氨基酸,成熟蛋白分子量11.377 k D,等电点4.72,具有化学感受蛋白典型的4个保守半胱氨酸位点特征。Focc CSP1与东亚飞蝗Locusta migratoria Lmig CSP(Gen Bank登录号:CAJ01476.1)的氨基酸序列一致性最高,进化关系最近。Focc CSP1在西花蓟马不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达,在羽化1 d的雌虫中相对表达量最高,其次是2龄若虫,蛹和成虫后期表达量最低;在触角和足中相对表达量较高。成功构建了重组表达质粒p ET-30a/Focc CSP1,并诱导表达,经Ni柱纯化,获得目的蛋白;免疫定位表明,该蛋白在西花蓟马触角、足、头等部位血淋巴中均大量存在。【结论】明确了西花蓟马化学感受蛋白基因Focc CSP1的核苷酸、氨基酸序列特征。Focc CSP1广泛分布在西花蓟马多个组织及各个发育期,据此推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、感受机械刺激以及调节生长发育等方面扮演重要角色。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白与MOAP-1的相互作用

【目的】探讨A型流感病毒PB1-F2蛋白和人类凋亡调节因子1(MOAP-1)之间的相互作用。【方法】构建pACT2-MOAP-1重组质粒,与pGBKT7-PB1-F2质粒共转化酵母AH109,检测转化菌在四缺培养基的生长情况及β半乳糖苷酶报告基因的活性;利用GST pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步验证PB1-F2与宿主细胞蛋白MOAP-1的相互作用;通过过表达PB1-F2和MOAP-1,检测PB1-F2对MOAP-1蛋白表达水平的影响。【结果】酵母双杂交结果表明,PB1-F2和MOAP-1可以在酵母细胞内特异性结合。GST pull-down和Co-IP实验也进一步证实了这两种蛋白的相互作用,而且PB1-F2可上调外源MOAP-1的蛋白水平。【结论】流感病毒PB1-F2与MOAP-1存在相互作用,PB1-F2可能通过与MOAP-1的相互作用参与调控细胞生长及凋亡过程。     

鉴定人甲基化CpG结合结构域蛋白4为蛋白激酶X的底物

人蛋白激酶X(PrKX)是由X染色体编码的一种cAMP依赖性蛋白激酶,但是到目前为止已鉴定到的PrKX底物还很少.为了鉴定蛋白激酶X的底物,我们以蛋白激酶X为诱饵进行了酵母双杂交实验,结果发现甲基化CpG结合结构域蛋白4(MBD4)与PrKX在酵母细胞内相互作用较强.GST融合蛋白沉降和细胞内蛋白质的免疫共沉淀证实PrKX与MBD4之间确实存在相互作用.进一步研究表明,大肠杆菌中表达的重组MBD4在体外可以被PrKX磷酸化,而且MBD4蛋白的磷酸化能明显增强它在体外与甲基化DNA探针的结合活性.     

BEX2与INI1/hSNF5蛋白的相互作用及其在细胞周期中的功能鉴定

BEX2(Brain expressed X-linked protein 2)分子量约为13 kDa,高表达于人的脑和睾丸中。据报道,该蛋白在胚胎发育中表达量变化巨大,提示该蛋白可能在胚胎发育中具有重要作用,但迄今为止,其功能知之甚少。文章应用酵母双杂交系统,以BEX2为"诱饵"蛋白,筛选发现INI1/hSNF5是BEX2的一个结合蛋白。INI1/hSNF5是SWI/SNF染色质重塑复合体的核心组分,是"表观遗传"分子机制中的重要成员。文章通过体外GST Pull-down实验验证,BEX2与INI1/hSNF5之间的相互作是直接并且特异的。通过进一步的缺失突变分析,表明INI1/hSNF5的两个保守的反向重复序列是BEX2的结合区域。该区域是SNF5与多种蛋白相互作用的结构平台。亚细胞定位分析显示BEX2与INI1/hSNF5都主要集中分布于细胞核,这表明二者之间的相互作用可能参与基因表达调控的过程。文章进一步对此相互作用的功能进行了探讨,发现BEX2通过与INI1/hSNF5的相互作用从而影响细胞周期。     

ORP8与SPAG5相互作用并影响细胞周期

目的：筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8（Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8）相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能。方法：构建重组诱饵质粒pGBKT7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal cDNA文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GSTPull-down以及免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响。结果：酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5（Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5）,体外GSTpull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少。结论：SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用。ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索     

ATP6蛋白影响异沙叶蝉对小麦蓝矮植 原体的传播效率

【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma, WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为诱饵,从异沙叶蝉cDNA文库杂交筛选互作蛋白;通过RNAi沉默ATP6基因,验证ATP6蛋白对异沙叶蝉3龄若虫传播WBDp的影响。【结果】构建了异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库,用P2-4从cDNA文库中杂交筛选获得了ATP6等多种互作蛋白。RNAi结果发现沉默ATP6基因后异沙叶蝉3龄若虫的WBDp传播率比对照组显著下降了23.33%±3.33%,表明ATP6是异沙叶蝉参与WBDp传播的关键蛋白。【结论】明确了异沙叶蝉ATP6是参与WBDp传播的一个关键蛋白。为进一步探明异沙叶蝉传播WBDp的分子机制和植原体病害的田间防治提供了理论基础。     

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白——泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验. 以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因（UBA52）的cDNA序列有高度同源性（100％）. GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用. 本实验证明,人泛素-52氨基酸（UBA52）融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白, 它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.     

Hepatitis C virus ARFP/F protein interacts with cellular MM-1 protein and enhances the gene trans-activation activity of c-Myc

The ARFP/F protein is synthesized from the +1 reading frame of the hepatitis C virus (HCV) core protein gene. The function of this protein remains unknown. To study the function of the HCV ARFP/F protein, we have conducted the yeast two-hybrid screening experiment to identify cellular proteins that may interact with the ARFP/F protein. MM-1, a c-Myc interacting protein, was found to interact with HCV ARFP/F protein in this experiment. The physical interaction between ARFP/F and MM-1 proteins was further confirmed by the GST pull-down assay, the co-immunoprecipitation assay and confocal microscopy. As MM-1 can inhibit the gene transactivation activity of c-Myc, we have conducted further analysis to examine the possible effect of the ARFP/F protein on c-Myc. Our results indicate that the HCV ARFP/F protein can enhance the gene trans-activation activity of c-Myc, apparently by antagonizing the inhibitory effect of MM-1. The ability of the ARFP/F protein to enhance the activity of c-Myc raises the possibility that ARFP/F protein might play a role in hepatocellular transformation in HCV patients. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

ORP8 与SPAG5 相互作用并影响细胞周期

目的:筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8)相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能.方法:构建重组诱饵质粒Pgbkt7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal Cdna文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GST Pull-down以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响.结果:酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5(Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5),体外GST pull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少.结论:SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用.ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索     

Vaccinia virus A36R membrane protein provides a direct link between intracellular enveloped virions and the microtubule motor kinesin

Previous work demonstrated that intracellular enveloped vaccinia virus virions use microtubules to move from the site of membrane wrapping to the cell periphery. The mechanism and direction of intracellular virion movement predicted that viral proteins directly or indirectly interact with the microtubule motor protein kinesin. The yeast two-hybrid assay was used to test for interactions between the light chain of kinesin and the cytoplasmic tails from five viral envelope proteins. We found that the N-terminal tetratricopeptide repeat region of the kinesin light chain (KLC-TPR) interacted with the cytoplasmic tail of the viral A36R protein. A series of C- and N-terminal truncations of A36R further defined a region from residues 81 to 111 that was sufficient for interaction with KLC-TPR. Interactions were confirmed by using pull-down assays with purified glutathione S-transferase (GST)-A36R and (35)S-labeled KLC-TPR. The defined region on A36R for interaction with kinesin overlaps the recently defined region (residues 91 to 111) for interaction with the A33R envelope protein. The yeast three-hybrid system was used to demonstrate that expression of A33R interrupted the interaction between A36R and KLC-TPR, indicating that the binding of A36R is mutually exclusive to either A33R or kinesin. Pull-down assays with purified GST-A36R and (35)S-labeled KLC-TPR in the presence of competing A33R corroborated these findings. Collectively, these results demonstrated that the viral A36R protein interacts directly with the microtubule motor protein kinesin and that the viral protein A33R may regulate this interaction.