hCG对绒癌细胞系MMP-2和MMP-8表达的影响

为了探讨人绒毛膜促性腺激素（hCG)对绒并且吕细胞侵袭性相关基因表达的影响作用。采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测方法,观察了不同浓度hCG不同处理时间对JEG-3绒癌细胞系表达基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-8）的影响。结果显示,绒癌细胞系JEG-3表达MMP-2和MMP-8;分别用0、50、500、5000、25000IU/LhCG处理48h后,JEG-3细胞中MMP-2mRNA的含量无明显变化。MMP-8mRNA的表达则被诱导,并随hCG作用浓度增高而增强,进一步研究处理时间对MMP表达的影响。结果发现经25000IU/LhCG处理的JEG-3细胞,MMP-8的表达随处理时间的延长逐渐增强,而MMP-2的表达则在第6h被显著诱导后逐渐降低,以上结果提示,hCG可诱导绒癌细胞系JEG-3中MMP-2和MMP-8两种基质金属蛋白酶的表达,并因此可能对绒癌细胞系的侵袭性具有影响作用。然而hCG对这两者表达的影响规律并不完全一致。     

eNOS基因在JAR细胞中的表达

本研究应用脂质体介导转染技术将人内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转入绒癌细胞系JAR细胞 ,获得转染阳性细胞。用RT PCR和Westernblot技术从基因及蛋白水平对表达产物进行鉴定 ,结果显示 :有较高水平的mRNA转录和特异目的蛋白表达 ;通过免疫细胞化学方法证实 ,转染eNOS基因的阳性JAR细胞与对照组相比 ,有外源eNOS蛋白高表达 ;但是一氧化氮合酶 (NOS)活性及其催化产物NO并没有直接升高 ;使用A2 3187处理则能增加NOS的活性 ,说明在转染的JAR细胞中 ,NOS没有被直接激活     

集胞藻6803中ndhK基因启动子结构与功能的初步分析

ndhK是蓝藻NDH-1复合体的1个亚基编码基因,其表达受低浓度CO2和高光的诱导,对于蓝藻应对低CO2胁迫起着重要的作用。为进一步阐明ndhK基因的转录调控机制,本研究利用5′-RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了该基因的转录起始位点,利用生物信息学预测发现ndhK基因含有4个可能的启动子,构建了含增强型黄色荧光蛋白报告基因的启动子探针型载体,并利用蛋白免疫印迹的方法进行检测。结果表明:在集胞藻6803的ndhK基因上游的-374～-274bp,-438～-374bp,-604～-543bp,+1～+52bp区域具有较高的启动子活性,而-543～-440bp区域则可能存在1个抑制ndhK基因表达的转录因子。     

环腺苷一磷酸对人Ⅰ型17β羟类固醇脱氢酶在绒癌细胞系中表达的调节作用

由Ｈ ＳＤ１７Ｂ１基因编码的人Ⅰ型１７β－羟类固醇脱氢酶（１７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｔｙｐｅ１简称Ⅰ型１７ＨＳＤ）催化雌酮与雌二醇之间的转化。本文研究环腺苷一磷酸简化（ｃＡＭＰ）对该酶在培养的绒癌胞系（ＪＡＲ和ＪＥＧ－３）中表达的调节作用。用８－ｂｒｏｍｏ－ｃＡＭＰ处理两种绒癌细胞后,观察到在伴随１．３ｋｂⅠ型１７ＨＳＤｍＲＮＡ表达的同时,Ｉ型１７ＨＳＤ蛋白浓度     

用于植物的铜诱导基因表达系统的改进

铜诱导基因表达系统已被用于植物转基因表达的时空调控。它由两部分构成：(1)组成型或器官专一性表达的aceI基因编码铜反应性的转录因子;(2)融合启动子控制下的目的基因,融合启动子由含ACE1结合位点的金属反应元件(MRE)连接CaMV 35S(-90- 8)启动子组成。本实验测试了来自酵母金属硫蛋白基因5′调控区的两个不同的AcE1结合区域在转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)中的效果。结果表明,与MRE(-148～-105)相比,使用MRE(-210～-126)的铜诱导系统效率增加50％到100％。在植物生物技术中使用这一系统控制基因性状是很有潜力的。     

芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达

【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定（英文）

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2 (17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C_(17)位点氧化17β-雌二醇,其K_m值为0.082 mmol/L,V_(max)值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

双启动子对重组溶源性枯草杆菌中外源蛋白表达的增强作用

探讨了双启动子对基于溶源性噬菌体构建的重组枯草杆菌中外源蛋白表达的影响。分别将不含或含有本身启动子的α-淀粉酶基因(来源于Bacillus amyloliquefaciens)和青霉素酰化酶基因(来源于Bacillus megaterium)克隆到溶源性枯草杆菌中,得到重组菌B.subtilisAMY1,B.subtilisAMY2,B.subtilisPA1以及B.subtilisPA2。由于同源重组,所克隆的片段整合到溶源性枯草杆菌中的噬菌体基因组上,并处于噬菌体强启动子的下游。在重组菌AMY1和PA1中,在热诱导的情况下外源基因的转录只受到噬菌体启动子的作用,而在重组菌AMY2和PA2中,在热诱导下外源基因的转录同时受到噬菌体启动子和基因本身所带启动子的作用。双启动子的应用使重组α-淀粉酶的表达量提高了133%,使重组青霉素酰化酶的表达量提高了113%。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C17位点氧化17β-雌二醇,其Km值为0.082 mmol/L,Vmax值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

羟基脲诱导前后HEL细胞内GATA转录因子与人β—类珠蛋白基因调控元件的结合模式分析

HEL细胞是一株人红白血病细胞株,其中成年型β-珠蛋白基因不能表达。我们以往的试验证明,羟基脲诱导以后,能使HEL细胞内成年型β-珠蛋白基因表达。本文以此为模型,探索了β-珠蛋白基因在HEL细胞内诱导表达的分子机制。结果表明,羟基脲诱导之后,与人β-珠蛋白基因5’远侧端DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列以及近侧端启动子DNA序列相结合的GATA-1蛋白因子量明显增多,而GATA-2蛋白因子量明显减少。结果显示,GATA蛋白家族各成员在HEL细胞分化及珠蛋白基因表达的过程中扮演着不同的角色。推测GATA-1可能有促进β-珠蛋白基因的表达,使HEL细胞趋向终末分化的作用,GATA-2则可能与胚胎型珠蛋白基因表达有关,并有抑制红细胞向终末分化的功能。     

用于植物的铜诱导基因表达系统的改进

铜诱导基因表达系统已被用于植物转基因表达的时空调控.它由两部分构成:(1)组成型或器官专一性表达的acel基因编码铜反应性的转录因子;(2)融合启动子控制下的目的基因,融合启动子由含ACE1结合位点的金属反应元件(MRE)连接CaMV 35S(-90～+8)启动子组成.本实验测试了来自酵母金属硫蛋白基因5′调控区的两个不同的ACE1结合区域在转基因烟草(Nicotiana tabacum L. cv.W38)中的效果.结果表明,与MRE(-148～-105)相比,使用MRE(-210～-126)的铜诱导系统效率增加50%到100%.在植物生物技术中使用这一系统控制基因性状是很有潜力的.     

NF-κB结合位点在LPS诱导人TNF-α基因转录中的调节作用

为探讨人TNF α基因启动子区域NF κB结合位点对LPS诱导性基因表达的调节作用 ,将构建的含人TNF α基因启动子区域及其不同缺失片段的pGL2萤光素酶报道基因重组体 ,体外转染HL 60细胞 ,观察LPS刺激对TNF基因启动子指导萤光素酶表达的影响 .发现TNF α基因启动子区域的 3个NF κB结合位点的存在是该基因最大组成性表达和LPS诱导性表达所必需 ;将这 3个位点缺失可完全阻断报道基因的LPS诱导性表达 ,并使其组成性表达明显受到抑制 (P <0 .0 0 1) .缺失κB1和κB2位点 ,使基因组成性表达与LPS诱导性表达均减少约 50 % (P <0 .0 1) ,但诱导倍数则与非突变体相近 ;反之 ,用κB3反义寡核苷酸封闭κB3位点 ,保留κB1和κB2功能 ,使LPS诱导性基因表达抑制 70 % (P <0 .0 0 1) ,诱导倍数明显降低 .保留原有κB3位点 ,再将κB3位点取代κB1和κB2位点 ,可使基因组成性和诱导性表达几乎完全恢复 ;将κB3位点向TSS移近 (- 98→ - 52 ) ,取代Sp1位点 ,虽然κB1和κB2位点仍然缺失 ,但仅一个κB3位点即可使基因组成性和LPS诱导性表达恢复到 80 % .用反义寡核苷酸封闭这个κB3位点 ,不但可使TNF α启动子完全丧失对LPS的反应性 ,还可完全阻断所控基因的组成性表达 .结果表明 ,人TNF α启动子区域 3个NF κB位点均参与该     

启动子Pcpcβ提高鱼腥藻7120中hGM-CSF基因表达效率的研究

利用聚球藻7002中编码藻蓝蛋白基因(cpcβ)的启动子(Pcpcβ),替代穿梭表达载体pDC-GM中的启动子PpsbA,启动外源人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因在鱼腥藻7120中的表达。蛋白免疫印迹证实,在含Pcpcβ启动子的cGM藻株中,hGM-CSF基因的表达水平比原先构建的含PpsbA启动子的GM藻株中提高了90%,且该基因的高效表达对宿主细胞的生长未产生明显影响。结果表明,对于在蓝藻中表达hGM-CSF基因而言,Pcpcβ启动子可能是较适宜的强启动子之一。     

RARβ在胃癌细胞生长调节中的作用

为探讨 RARβ受体介导全反式视黄酸 ( ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理 ,用 Northern印迹测定 RARβ m RNA表达水平 ,脂质体介导的转染方法将含有 RARβ基因的表达载体转染MKN- 45细胞并稳定表达 ,MTT和软琼脂集落形成等实验测定细胞生长速率和生长状态 ,氯霉素乙酰转移酶活性 ( CAT)测定视黄酸应答元件βRARE的转录活性以及 AP- 1 ( activator protein- 1 )活性 .RARβ在 ATRA敏感细胞株 MGC80 - 3、BGC- 82 3和 SGC- 790 1中表达 ,而在 ATRA抗性细胞株 MKN- 45中不表达 .当 RARβ基因转染 MKN- 45细胞时 ,细胞变为 ATRA敏感 ,由此导致ATRA抑制 MKN- 45细胞生长和软琼脂集落形成 .ATRA可以加强诱导 MGC80 - 3、BGC- 82 3和SGC- 790 1细胞βRARE的转录活性 ,但对 MKN- 45细胞影响不大 ,不能抑制细胞 AP- 1活性 .当RARβ基因转染 MKN- 45细胞后 ,ATRA则能够诱导细胞 βRARE的转录活性 ,并抑制细胞的 AP-1活性 .RARβ表达与 ATRA抑制胃癌细胞生长密切相关 .ATRA诱导 βRARE转录活性和抑制AP- 1活性可能是其调控胃癌细胞生长的机制之一 .     

血清对全反式视黄酸抑制肺癌细胞生长的影响

 研究不同浓度的血清对全反式视黄酸 (ATRA)抑制肺癌细胞生长的影响 .当细胞培养在 10 %血清中 ,ATRA不能抑制肺癌细胞生长 ,但是当细胞培养在 1%血清中 ,ATRA能够有效地抑制肺癌细胞生长 .视黄酸受体RARβ介导视黄酸的抗癌作用 .Northern印迹分析表明 ,在高浓度血清中AT RA不能诱导RARβ表达 ,但在低浓度血清中ATRA可以诱导RARβ表达 ,并且瞬时转染和CAT测定证实是通过激活RABβ启动子转录活性而诱导RARβ表达的 .孤生受体Nur77受到血清生长因子刺激后会大量表达 ,具有抗视黄酸活性的作用 .肺癌细胞培养在低浓度血清中 ,Nur77mRNA低水平表达和Nur77蛋白不表达 .然而在高浓度血清中 ,Nur77mRNA和蛋白高水平表达 .另外 ,在无血清条件下 ,EGF也可以诱导Nur77表达 .结果提示 ,血清中的生长因子可能拮抗ATRA抑制肺癌细胞生长的作用 ,其作用途径可能是通过刺激细胞中Nur77表达 ,或者通过下调RARβ启动子的转录活性而抑制RARβ的表达     

棘孢木霉糖苷水解酶3基因家族的生物信息学及表达模式分析

【背景】糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH) 3基因家族成员主要编码胞外β-葡萄糖苷酶,是纤维素降解中的关键酶。【目的】鉴定棘孢木霉GH3基因家族成员,探究其在纤维素降解过程中转录水平的表达模式。【方法】通过生物信息学方法对棘孢木霉GH3基因家族成员进行鉴定,对其基因结构、系统进化、蛋白理化性质、亚细胞定位及蛋白质三级结构进行分析,并采用荧光定量PCR技术对纤维素诱导下转录水平的表达模式进行综合分析。【结果】棘孢木霉基因组共鉴定到16个GH3基因家族成员,含有1-8个外显子,编码蛋白质长度为533-934个氨基酸,分子量为57.82-101.91 kDa,大多数为胞外蛋白。系统发育表明,该基因家族成员可分为4组,与里氏木霉的相似性较高。基因表达模式分析表明,纤维素诱导下,16个GH3基因均有表达,但不同成员在转录水平的表达存在差异。其中,1个基因呈组成型表达,2个基因表达下调,13个基因表达上调。棘孢木霉的胞外β-葡萄糖苷酶活力在纤维素诱导下明显提升,与GH3基因家族成员在转录水平的整体表达模式相一致。【结论】棘孢木霉基因组共包含16个GH3基因家族成员,而且多...     

甲状腺转录因子-1融合表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建人甲状腺转录因子-1(TTF1)编码基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)C-TTF1,并观察其蛋白质体外转录翻译情况。方法:据已知的TTF1基因序列,应用巢式PCR技术,从人肺腺癌细胞株SPC-A1中扩增出TTF1基因,通过TA连接将其克隆入pGEM-T-easy载体,经测序鉴定后,双酶切插入真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)C中;重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,进行蛋白质体外翻译观察TTF1体外表达情况,用电泳迁移率变动分析(EMSA)验证获得的体外翻译蛋白TTF1是否具有与下游靶基因UGRP1启动子结合的能力。结果:成功构建了含TTF1编码基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)C-TTF1,并能在体外表达TTF1蛋白。结论:能方便地获得TTF1体外翻译蛋白,为进一步研究TTF1蛋白与相应的DNA反应元件及其他转录因子的相互作用奠定了基础。     

人神经母细胞瘤株中β-淀粉样前体蛋白基因IL-1反应元件的研究

细胞团子IL-1β可以诱导SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中APP基因的转录．为了研究APP基因启动子区的IL-1β反应元件,用含不同长度APP启动子片段的报告基因载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞,发现APP启动子在SH-SY5Y细胞中有较强活性,其中-488到-303区为IL-1β诱导APP转录活性增加所必需,这个区域包括1个AP1结合位点和1个HSE元件．     

CREB4基因的表达谱分析和功能初步研究

cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelement-bindingproteins,CREB)是一个哺乳动物转录因子家族,通过cAMP反应元件(cAMPresponseelement,CRE)介导cAMP和钙离子依赖性基因表达。CREB4是CREB转录家族的新成员。人肿瘤MTCpanel结果显示,CREB4在人肺癌LX-1、结肠腺癌CX-1、前列腺癌PC-3、结肠癌G1-112和胰腺癌G1-103中有表达。构建表达CREB4-LexA和CREB215~395aa-LexA的pLexA融合质粒分别转化含p8opLacZ报告质粒的酵母EGY48菌株,诱导表达后发现CREB4蛋白为转录激活因子,N端决定其转录激活活性。亚细胞定位结果显示,全长CREB4蛋白定位于细胞质,而缺失C端假定转膜结构域的CREB41~275aa蛋白突变体则转移至细胞核内。表达谱结果显示CREB4蛋白可能在人多种肿瘤组织的基因表达调控中起作用,其C端假定的转膜结构域与其转录激活功能密切相关。     

人牙本质涎磷蛋白启动子驱动LacZ报告基因在人牙胚间充质细胞中表达

牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达是细胞向成牙本质细胞分化的标志。试图分析人DSPP启动子及构建人DSPP启动子驱动的Lac Z基因表达的报告体系,从而方便快捷检测细胞是否向成牙本质细胞分化。为了建立能表达DSPP的细胞体系,分离了人牙胚间充质细胞,并用地塞米松诱导培养液进行诱导,结果显示,该诱导培养液能有效地诱导人牙胚间充质细胞DSPP基因的表达。利用双荧光素酶报告系统对4段人DSPP基因5′上游区域(-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54)进行分析,结果显示-2 500-+54区域的启动子活性最高。5′上游区从?2 500 bp延长到?4 000 bp时,启动子活性下降;5′上游区从-2 500 bp缩短至-1 447 bp时,启动子活性下降;再次将-1 447 bp缩短至-1 027 bp时,启动子活性进一步下降。结果暗示在-4 000 bp至-2 500 bp区域存在转录抑制元件,-2 500 bp至-1 027 bp区域存在转录激活元件。用-2 500-+54启动子区域和Lac Z基因构建ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体,并分别在人牙胚间充质细胞和永生化人牙胚间充质细胞系ih EDMC4上检测ph DSPP-Lac Z报告载体的功能,通过X-Gal染色,结果显示在2种细胞牙向分化过程中均可检测到Lac Z基因的表达。研究构建的ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体可为诱导人源细胞牙向分化、牙齿发育、牙齿再生工程等研究中DSPP的表达检测提供一种更加便捷的手段。