NF-κB结合位点在LPS诱导人TNF-α基因转录中的调节作用

为探讨人TNF α基因启动子区域NF κB结合位点对LPS诱导性基因表达的调节作用 ,将构建的含人TNF α基因启动子区域及其不同缺失片段的pGL2萤光素酶报道基因重组体 ,体外转染HL 60细胞 ,观察LPS刺激对TNF基因启动子指导萤光素酶表达的影响 .发现TNF α基因启动子区域的 3个NF κB结合位点的存在是该基因最大组成性表达和LPS诱导性表达所必需 ;将这 3个位点缺失可完全阻断报道基因的LPS诱导性表达 ,并使其组成性表达明显受到抑制 (P <0 .0 0 1) .缺失κB1和κB2位点 ,使基因组成性表达与LPS诱导性表达均减少约 50 % (P <0 .0 1) ,但诱导倍数则与非突变体相近 ;反之 ,用κB3反义寡核苷酸封闭κB3位点 ,保留κB1和κB2功能 ,使LPS诱导性基因表达抑制 70 % (P <0 .0 0 1) ,诱导倍数明显降低 .保留原有κB3位点 ,再将κB3位点取代κB1和κB2位点 ,可使基因组成性和诱导性表达几乎完全恢复 ;将κB3位点向TSS移近 (- 98→ - 52 ) ,取代Sp1位点 ,虽然κB1和κB2位点仍然缺失 ,但仅一个κB3位点即可使基因组成性和LPS诱导性表达恢复到 80 % .用反义寡核苷酸封闭这个κB3位点 ,不但可使TNF α启动子完全丧失对LPS的反应性 ,还可完全阻断所控基因的组成性表达 .结果表明 ,人TNF α启动子区域 3个NF κB位点均参与该     

低分子量透明质酸片段通过toll样受体4信号途径激活枯否细胞

高分子量透明质酸（high-molecular-weight hyaluronic acid,HMW-HA）是重要的肝脏基质,分子量高达2×10^6Da以上,可被活性氧分子（reactive oxygen species,ROS）等降解成低分子量透明质酸片段（hyaluronic acid fragments,HA fragments）,后者能被toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）识别并激活免疫细胞诱发炎症反应。基于枯否细胞表达TLR4,推测HA fragments通过激活枯否细胞TLR4信号系统而启动肝脏缺血再灌注损伤。从TLR4基因突变型（C3H／HeJ,TLR4^Mut/Mut）及野生型（C3H／HeN,TLR4^＋/＋）小鼠分离肝脏枯否细胞常规培养,用酶降解及色谱柱分离方法制备HA fragments,观察HMW-HA及HA fragments激活枯否细胞的差异,检测培养上清肿瘤坏死因子-α或白介素-1β水平变化;枯否细胞p38MAPK信号通路的活化;用特异性p38MAPK阻断剂—SB-203580,阻断p38MAPK活化后,观察培养上清中肿瘤坏死因子-α或白介素-1β水平变化。结果显示HA fragments可以促进TLR4^＋/＋枯否细胞分泌促炎因子,不能诱导TLR4^Mut/Mut枯否细胞分泌促炎因子。而HMW-HA既不能促进TLR4^＋/＋枯否细胞也不能促进TLR4^Mut/Mut枯否细胞分泌促炎因子。采用多黏菌素中和脂多糖后,HA fragments促进TLR4^＋/＋枯否细胞分泌促炎因子的能力不变,这一过程伴随p38MAPK信号通路的活化。当运用p38MAPK信号通路的特异性阻断剂SB-203580,抑制p38MAPK活性时,HA fragments促进TLR4^＋/＋枯否细胞分泌促炎因子的能力显著下降。因此与基质组成成分HMW-HA不同,HA fragments可以通过TLR4激活枯否细胞,促进其分泌促炎因子诱发炎症反应,这一过程依赖于p38MAPK的激活。     

Northern Blot分析与原位杂交对大鼠腹腔巨噬细胞TNF－αmRNA检测的比较

本文比较了Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ与原位杂交对大鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）ＴＮＦ－αｍＲＮＡ的检测结果。对照组Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ为阴性,而原位杂交则见胞浆内有一定量ＴＮＦ－αｍＲＮＡ存在;ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）刺激组,则两种方法均显示Ｍ转录ＴＮＦ－αｍＲＮＡ明显增多。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ可对此作定量比较,而原位杂交则显示该ｍＲＮＡ在核周围相对较密。两种方法结合,可互相取长补短,以利更好、更全面地观察、分析某种基因变化。     

bcl-2与FAS在NO介导的肝细胞凋亡中的作用

目的　探讨bcl 2与FAS在NO介导的重型肝炎肝细胞凋亡中的作用。方法　雌性Balb/C小鼠 2 4只随机分为A、B、C、D 4组 ,每组 6只 ,分别为正常对照组、模型组、L Arg干预组 (NO供体干预 )、L NAME干预组 (NOS抑制剂干预 )。各组动物均于用药后 6h处死 ,留取血清、肝组织。用Griess法测定血清NO代谢产物NO-2 ,TUNEL原位检测肝细胞凋亡状况并计算凋亡指数 ,免疫组织化学法检测各组肝组织Fas表达及原位杂交技术检测各组肝组织bcl 2mRNA的表达。结果　 1.应用NO合成干预因素后 ,C组及D组NO-2 水平分别较B组升高及降低。 2 .正常肝组织经TUNEL检测未见凋亡细胞 ,其凋亡指数为 0。B组存在肝细胞凋亡现象 ,凋亡指数为 16 2 7% ,C组凋亡指数上升 (2 4 5 2 % ) ,而D组凋亡指数下降 (7 92 ) % ,组间比较有显著性差异 ,P值 <0 0 1。 3.正常肝细胞内未见Fas蛋白及bcl 2mRNA表达。B组Fas表达较广泛 ,C及D组Fas表达呈不同程度的增强和减弱 ;组间比较差异有显著性 ,P值 <0 0 1。B组及C组均未见bcl 2mRNA杂交信号 ,仅D组见肝细胞内出现杂交信号。结论　高水平的NO具有明显的促进肝细胞凋亡的作用。NO对于肝细胞的损伤可以通过介导凋亡的方式实现。NO在介导肝细胞凋亡的过程中 ,启动了FAS凋亡途径 ,而抑制NO的过量产生可     

反向信号传递

有关反向信号传递的研究多集中于TNF配体超家族成员,如TM-TNF、CD40L、CD30L、FasL等。当表达于细胞膜表面的TNF配体超家族分子,与相应的受体结合后,引起反向信号传递及靶细胞的多种生物学效应。研究发现,某些膜表面配体胞浆段具有一些磷酸化位点或CKI位点,也有人通过免疫共沉淀方法得到与胞浆段结合的蛋白分子,以及p38／MAPK活化等,然而反向信号传递确切的分子机制仍不清楚。对其进一步深入研究将有助于人们更好地理解细胞间的“握手”。