抑制性消减杂交法筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因

为了筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因,本研究以培养36 h(抗生素分泌前)的炭样小单孢菌JXNU-1菌体所合成c DNA为Driver,以培养108 h(抗生素分泌后)的菌体所合成的c DNA为Tester,构建炭样小单孢菌JXNU-1分泌抗生素前后的差异c DNA消减文库,筛选差异表达基因,荧光定量PCR验证其表达量,生物信息学方法分析其功能。研究结果表明,经抑制性消减杂交筛选得到5个与抗生素合成相关的差异表达基因;比照炭样小单孢菌JXNU-1全基因组序列,将所获5个基因定位到4个生物合成基因簇中,最后确定了炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相关的基因簇。本研究为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机制提供了实验依据。     

炭样小单孢菌中抗生素生物合成相关蛋白的筛选

目的：筛选一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成相关蛋白。方法：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术对JXNU-1菌体生长期（36h）和产物合成期（108h）的差异蛋白进行鉴定和功能分析。结果：基于iTRAQ定量蛋白质组学技术共鉴定出炭样小单孢菌总蛋白质2390个,差异表达蛋白172个,在产物合成期（108h）表达上调76个、表达下调96个。通过蛋白GO和COG注释等功能分析,筛选出12个与抗生素合成密切相关蛋白和5个生物合成基因簇。结论：利用iTRAQ技术筛选出炭样小单孢菌JXNU-1的抗生素合成相关蛋白,为阐明该抗生素的生物合成机制奠定实验依据。     

一株具有广谱抗菌活性炭样小单孢菌的全基因组序列测定

【目的】炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的放线菌,研究揭示该菌的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对炭样小单孢菌JXNU-1的基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学分析。【结果】对炭样小单孢菌JXNU-1的全基因组序列进行了测定和注释,得到基因组精细图,相关序列已提交GenBank,获得登录号为JXSX00000000。【结论】研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1抗生素产生机制及其抗菌机理提供了基础数据,对进一步研发其抗生素具有重要的理论意义和巨大的应用价值。     

炭样小单孢菌JXNU-1基因打靶载体的构建

小单孢菌属放线菌是许多生物活性物质的重要来源,但自然条件下小单孢菌的活性产物产率普遍偏低,基因编辑与改造对提高小单孢菌属放线菌活性产物的产率具有重要意义。然而,有效的遗传转化体系成为小单孢菌属放线菌基因编辑改造的瓶颈。炭样小单孢菌JXUN-1是实验室从南昌瑶湖农田土壤样品中分离到的一株具有广谱抗菌活性的放线菌,其基因组具有GC含量高的特点。本研究以敲除炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因P450为例,以温敏型质粒pKC1139为模板,构建了炭样小单孢菌JXNU-1 P450基因打靶载体p FD306,然后通过电转化将pFD306导入炭样小单孢菌JXNU-1新鲜菌丝体内,通过双交换获得基因缺失株炭样小单孢菌JXNU-ΔP450,最后通过PCR验证了菌株P450基因的缺失,表明炭样小单孢菌JXNU-1基因打靶载体pFD306构建成功。本研究确证了质粒pKC1139可以用于炭样小单孢菌JXNU-1基因组的编辑,为炭样小单孢菌JXNU-1抗生素合成相关基因的筛选及其功能研究提供有效帮助。     

炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX对嗜根考克氏菌肽聚糖合成的影响及其机理

为了揭示一株具有广谱抗菌活性炭样小单孢菌JXNU-1产的核苷类抗生素JX对嗜根考克氏菌肽聚糖合成的影响,本研究采用超声破壁、称重法研究抗生素对嗜根考克氏菌细胞壁含量变化,采用iTRAQ技术对抗生素处理前、后嗜根考克氏菌的蛋白质组进行比较分析。结果显示,在抗生素JX作用下,嗜根考克氏菌细胞分裂被抑制,细胞壁含量升高;iTRAQ技术鉴定了抗生素胁迫下的嗜根考克氏菌细胞中的1 780个蛋白,其中差异表达蛋白149个,包括表达上调蛋白106个,表达下调蛋白43个,上调表达蛋白中包括有一与肽聚糖合成的相关酶MurG。本研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX的抗菌作用机制提供了基础数据。     

一株重寄生枝孢菌的基因组测序及重寄生机制分析

【背景】枝孢菌SYC63是一株具有重寄生作用和抗菌活性的潜在生防菌株,目前尚无研究报道该菌株的全基因组序列,因此限制了其开发与利用。对该菌株进行基因组测序与分析,将进一步了解其重寄生的分子机制,为其在生物防治上的应用奠定研究基础。【目的】解析枝孢菌SYC63基因组序列信息,初步探究该菌的重寄生作用机制。【方法】利用二代高通量测序平台对枝孢菌SYC63进行全基因组测序,运用相关软件对其测序数据进行基因组组装、基因功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇并分析重寄生相关的碳水化合物酶类基因等。【结果】基因组组装后共得到17个contigs,总长度为31 912 211 bp,GC含量为52.80%,预测到12 327个编码基因。其中,4 029、949和6 595个基因分别能在KEGG、COG和GO数据库中被注释到,同时还预测到25个次级代谢产物合成基因簇。对重寄生机制相关的碳水化合物酶类进行分析并与重寄生菌株(拟盘多毛孢菌、木霉及盾壳霉)比较,发现该菌具有较多的糖苷水解酶和糖脂酶基因,而且细胞壁降解酶类基因经锈菌孢子壁处理后在转录组测序中显著上调表达,初步分析了该菌与重寄生木霉在分子水平上的...     

小单孢菌(Micromonospora rosaria)DSM803全基因组测序及分析

小单孢菌(Micromonospora rosaria)DSM 803是一种高GC含量的革兰氏阳性放线菌,分离自美国德克萨斯州土壤,能够合成玫瑰霉素抗生素。目前,还没有相关研究报道Micromonospora rosaria的全基因组序列,这限制了代谢产物合成途径和比较基因组学等研究。本研究首次通过高通量测序技术对小单孢菌DSM803进行全基因组测序,使用Velvet软件进行组装拼接得到310个Contigs,整个基因组大小约7.38 Mbp,GC含量为73.4%,序列已提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Gen Bank数据库(LRQV00000000)。比较基因组学及玫瑰霉素合成途径相关基因分析结果显示:小单孢菌DSM 803在碳水化合物转运和代谢及信号转导功能方面要明显强于其它功能;玫瑰霉素生物合成基因簇由20个基因组成并分散于4个Contigs中。本研究首次报道了一株大环内酯类抗生素玫瑰霉素生产菌小单孢菌DSM 803的全基因组序列,分析了基因组基本特征,预测了次级代谢产物合成基因簇,探讨了玫瑰霉素生物合成途径,为后续的进一步代谢调控与合成生物学提供了理论基础。     

仁用杏果肉3个发育阶段的转录组分析

仁用杏果肉糖酸比低是造成其鲜食性差的主要原因。该研究以仁用杏‘山苦2号’开花后30、60和90d的果肉为材料,利用RNA-seq对仁用杏果肉进行转录组测序及差异表达基因的筛选,以了解可能与糖酸合成相关的基因及其表达模式,为进一步解析仁用杏果肉糖酸比低的分子调控模式与机制,深入研究仁用杏果肉糖酸代谢转化机制提供依据。结果显示:(1)在仁用杏果肉发育的3个阶段共获得差异表达的单基因簇(unigene)28 989条;根据单基因簇的功能注释,共发掘出19条单基因簇编码5个与仁用杏果肉中糖合成代谢相关的酶,54条单基因簇编码15个与仁用杏果肉中酸合成代谢相关的酶。(2)在所选3个发育阶段的仁用杏果肉中共发现9条与糖代谢相关的单基因簇和27条与酸代谢相关的单基因簇呈现差异表达。(3)编码与蔗糖合成积累相关的蔗糖磷酸酶和蔗糖合成酶的单基因簇主要呈下调表达,而与糖分解相关的果糖激酶和己糖激酶却呈上调表达。(4)与仁用杏果肉中主要有机酸组分苹果酸积累相关的苹果酸脱氢酶主要呈上调表达,而分解苹果酸的苹果酸酶呈下调表达。研究推测,仁用杏果肉在发育中糖积累受阻,而有机酸却得到大量的合成积累,这可能是造成仁用杏果肉糖酸比例小,鲜食口感差的主要内在因素之一。     

不同成熟度树葡萄叶片中类黄酮合成转录组基因分析

为了解树葡萄(Myrciaria cauliflora)类黄酮合成相关酶差异表达基因信息,对其幼叶和成熟叶进行全转录组测序并比较分析。结果表明,从树葡萄幼叶和成熟叶中获得59 321条单基因簇(Unigenes),在8大数据库共注释到32 912条Unigenes信息,其中类黄酮合成代谢相关酶基因77个,在成熟叶片中显著下调表达的基因6个,包括2个CHI、1个CHS、1个F3H、1个2-羟基异黄酮脱水酶基因和1个ANS。5个差异表达基因经qRT-PCR验证的结果与转录组测序结果相符合。因此,树葡萄叶片中含有大量不同种类黄酮合成代谢相关酶家族基因,成熟叶片中类黄酮含量显著减少是由于少量相关基因显著下调。     

转录组分析棒状链霉菌F613-1高产克拉维酸的分子基础

旨在探究S.clavuligerus工业菌株高产克拉维酸(CA)的分子基础。采用转录组高通量测序,对比标准菌株和高产CA的工业菌株F613-1之间的基因转录水平差异,结合菌株表型差异进行综合分析。结果表型比较显示,F613-1在固体培养基中生长速度、气生菌丝形态、孢子形成等方面与标准菌株存在差异。液体摇瓶培养中,菌体生长速度无明显变化,但F613-1的糖消耗量显著降低,同时CA产量比ATCC27064提高约11.7倍。转录组分析显示,F613-1中CA基因簇及其途径特异性调控基因的表达量显著升高,其副产物全霉素基因簇的表达量显著下降;CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛代谢相关基因的转录水平发生显著变化,精氨酸合成代谢基因上调,而3-磷酸甘油醛分解代谢基因下调;ABC转运系统中80多个基因的转录水平也发生明显变化,其中42个显著上调,38个显著下调。工业生产菌株高产克拉维酸的主要原因是CA基因簇及其调控基因表达量的升高、相关副产物基因簇的沉默及CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛的积累。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

多杀菌素生物合成基因簇启动子探测和转录时序

多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素.为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点,首先通过建立基于报告基因的启动子探测技术,探测了多杀菌素生物合成基因簇的9个启动子活性.并进一步通过荧光定量PCR,分析了这9个基因和不在基因簇内的负责糖基前体供应和鼠李糖合成的4个基因的转录时序,结果表明多杀菌素生物合成基因簇内的9个基因在菌体生长进入稳定期时有较高的转录,这和发酵液中此时开始大量积累多杀菌素一致;同时还发现,簇外的4个与糖基供应相关的基因和基因簇内基因的转录时序不同,它们在菌体生长对数期有较高的转录活性,这暗示多杀菌素聚酮链的合成速率和参与后修饰的糖基底物供应的最优化匹配有可能是提高生物合成多杀菌素的前提和关键.     

茶树种子发育过程的转录组分析

该研究以‘铁观音’茶树品种的种子为试验材料,采用转录组测序技术分析种子发育的3个时期(幼果期、膨大期、成熟期)的表达差异,探究茶树种子油脂代谢的分子机制。结果表明:(1)经转录组测序、组装后共获得30 940 581个clean reads,经数据合并拼接最终得到36 951条非冗余Unigene序列,其中28 476个Unigene可得到功能注释;在转录本中能够被注释到GO分类的Unigene有11 201条(30.3%),KEGG分析发现共有17 172个基因参与了127个代谢通路。(2)经KEGG通路筛选出14条与脂肪酸代谢相关的通路,且随着茶籽的发育,大部分脂肪酸调控途径相关基因呈下调趋势,其中上调基因数最多的有α-亚麻酸代谢途径和脂肪酸降解途径(有17个基因表达量上调),下调基因数最多的是甘油磷脂代谢途径(有58个基因表达量下调);在茶籽发育幼果期α-亚麻酸代谢途径中表达量上调的基因数超过表达量下调的基因数。(3)研究发现茶籽脂肪酸合成相关的基因涉及14个脂类调控途径,共409条差异基因;随着茶树种子发育到成熟期,上调的差异表达基因数量在减少,下调的差异表达基因数量增加,其中α-亚麻酸途径中的基因PLA2G16、DAD1、pldA、FabF、FabI表达量上调显著,随后表达量下调。(4)qRT-PCR检测结果表明,7个茶树FAD和1个ACP差异表达基因的水平与转录组测序结果基本一致;随着茶籽的发育,基因CsFAD7和Δ6-CsFAD从幼果期、果实膨大期至果实成熟期都为差异下调表达,CsFAD2、CsFAD6和Δ7-CsFAD为差异上调表达,CsFAD8、Δ8-CsFAD和CsACP在幼果期至果实膨大期差异上调表达,在果实膨大期至果实成熟期差异下调表达。     

小花草玉梅高通量转录组测序与花发育基因的挖掘

该研究采用高通量测序技术Illumina HiSeq 2000,对小花草玉梅花器官进行转录组测序,挖掘参与其花发育相关的基因。测序结果得到54 513 822个序列读取片段(reads),包含7 826 726 115bp的碱基序列信息。将测序数据进行序列组装后,获得43 767个单基因簇(unigenes),平均长度为926bp。转录物注释结果显示,28 130条unigenes有同源比对信息。在43 767条unigenes中检测到5 015个SSR位点,且SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的是AG/CT,其次是AAG/CTT和ACC/GGT。通过转录因子分析,进一步筛选得到了12个与花发育紧密相关的MADS基因,分别为FUL1,FUL2,AP3-1,AP3-2,AP3-3,PI1,PI2,AG1,AG2,SEP1,SEP3和AGL6。实时荧光定量PCR分析表明,与小花草玉梅正常花相比,全白、绿白相间、五瓣变异、全绿变异花中的FUL1、SEP1,SEP3和AGL6基因均显著上调表达,而12个基因在极端变异花中的表达水平与正常花的差异均不明显。定量结果经主成分分析显示,AGL6、SEP3、FUL1、PI2及SEP1的表达量均为小花草玉梅花形态建成的主要指标。研究结果在一定程度上丰富了小花草玉梅的基因信息,为后续研究其花器官变异的分子机制提供了基础数据。     

茶丽纹象甲为害诱导的茶树防御反应分析

基于转录组测序,获得了茶树新梢叶片被茶丽纹象甲为害前后的差异基因表达谱,并从信号监测与转导、转录因子、次生代谢物生成等方面分析了相关基因的表达变化情况,为进一步研究茶丽纹象甲为害诱导的茶树防御机制奠定基础。结果表明:(1)茶丽纹象甲为害茶树新梢叶片后共检测到显著上调表达基因309个,显著下调表达基因297个,这些显著差异表达基因共分成23类。(2)检测到信号监测与转导过程中合计17个单基因上调表达2.0～2.8倍,包括富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因、促分裂原活化蛋白激酶级联信号系统蛋白激酶基因、茉莉酸信号通路基因、钙离子信号基因、水杨酸代谢通路基因;检测到21个转录因子单基因上调表达1.8～2.8倍,包括bHLH、WRKY、bZIP、MYB、UAF等转录因子;检测到苯丙类、类黄酮及萜类物质代谢过程中合计8个单基因上调表达2.1～2.5倍,包括苯丙酮酸互变异构酶基因、肉桂酰辅酶A还原酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因、花色素还原酶基因、法尼基二磷酸合成酶基因、法尼醇脱氢酶基因。研究认为,茶丽纹象甲为害诱导信号转导、转录因子及次生代谢过程中的基因增量表达以机械损伤作用为主,昆虫口腔分泌物对这些基因的诱导表达具有协同促进作用。     

转录水平分析转速对克拉维酸发酵产量的影响机制

搅拌转速影响克拉维酸发酵水平,旨在研究搅拌转速影响棒状链霉菌F613-1克拉维酸(CA)生物合成的分子机制。采用转录组高通量测序,对比不同转速发酵条件之间的基因转录水平差异,分析克拉维酸代谢途径相关基因的转录水平变化。摇瓶发酵结果显示,高转速条件下F613-1的CA产量比低转速条件显著提高,发酵周期缩短。转录组分析显示,高转速条件下F613-1中CA合成基因簇中基因表达量无显著变化,但CA合成前体物质精氨酸和3-磷酸甘油醛代谢相关基因的转录水平发生显著变化,精氨酸合成基因簇中基因表达量明显升高,甘油代谢转化为3-磷酸甘油醛的基因表达量显著提高。因此,棒状链霉菌在高转速发酵条件下CA合成速度增加的主要原因是CA合成前体物质精氨酸和3-磷酸甘油醛的代谢活性增强和前体物质积累。     

不同温度条件下鲁氏耶尔森氏菌的链特异性转录组分析

为鉴定鱼源鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri) SC09菌株水生环境中不同温度的转录组水平上的差异, 研究采用链特异性转录组测序(Strand-specific RNA-seq)技术对菌体生理温度(28℃)和实验培养温度(37℃)下进行链特异性测序, 原始数据质控后, 筛选得到差异表达基因, 通过KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异表达基因进行富集分析, 并利用Rockhopper软件筛选出的重要原核生物基因簇进行验证。结果显示, 共筛选获得173个显著差异表达基因(P<0.05), 其中包括58个上调基因, 主要富集到一些特殊的碳水化合物代谢相关的通路中; 以及115个下调基因, 主要富集到双组份信号系统中与三羧酸循环相关的代谢通路上, 同时部分基因富集到编码鞭毛素相关的基因簇中。结果表明, 相对于37℃的实验室培养温度, 在水生环境的生理温度条件下(28℃) SC09菌株拥有较高的运动性和较强的葡萄糖代谢, 但相对的SC09菌株代谢一些特殊糖类的能力减弱。     

卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组测序及序列分析

棘孢小单胞菌(Micromonospora echinospora) ATCC 15837是一种高GC含量的革兰氏阳性稀有放线菌,能够合成烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素(calicheamicin, CLM)。目前,还没有相关研究报道棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,这限制了其代谢产物合成途径和比较基因组学等研究。本研究首次通过高通量测序技术对棘孢小单胞菌ATCC 15837进行全基因组测序,使用相关生物信息学软件对数据进行组装和注释等分析。使用Velvet软件进行组装拼接得到77个Contigs,GC含量为72.36%,基因组大小约为7.69 Mb。序列已提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(登录号为NGNT00000000)。本研究首次报道了一株烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,分析了基因组基本特征,预测了该菌株的次级代谢产物生物合成基因簇,为后续的进一步代谢调控与合成生物学提供了理论基础。     

基于转录组的八角挥发油合成相关基因挖掘与分析

为更好地挖掘八角(Illicium verum)挥发油合成相关基因，该文对挥发油性状差异显著的优良无性系桂角69号及普通品种砧01号叶片进行了转录组测序及组装注释，并对差异表达基因进行了GO分类和KEGG通路分析。结果表明：(1)转录本经组装后获得84 182条序列，使用NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、KOG、GO和Pfam数据库进行序列比对，共注释了59 161条序列，筛选出30 572个差异表达基因。与砧01号相比，桂角69号叶片中上调基因有15 025个，下调基因有15 547个。(2)GO分类结果显示共有20 287个差异基因被注释。KEGG分析结果表明，有21 600个差异基因被注释到133条KEGG通路上，其中挥发油合成相关的单萜生物合成通路、萜类骨架生物合成通路、苯丙素合成通路中的芳樟醇合酶、月桂烯合酶、香叶基香叶基焦磷酸合酶、肉桂酰辅酶A还原酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶等关键酶基因呈差异表达。(3)转录因子分析发现差异表达基因分布于31个转录因子家族，其中MYB家族序列数量最多。该文利用转录组测序技术分析八角优良无性系与普通品种叶片的差异基因及...