在活细胞中应用FRET技术研究TGFβ/TβRI信号传导

转移生长因子β(TGFβ)信号传导通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、细胞迁移等一系列细胞过程,与骨代谢疾病的发病机制密切相关.本研究根据荧光共振能量转移(FRET)技术原理,构建包含CFP-TβRI-YFP融合蛋白的TβRI生物传感器,转染293T细胞,观察转染效率.以TGFβ1为诱导剂,激活TGFβ/TβRI信号传导通路,在活细胞生理条件下,动态监测TβRI生物传感器的FRET效应.结果表明,成功构建了TβRI生物传感器,转染细胞效率达50%,在TGFβ1诱导刺激6min后,FRET效率增加并达到最大值,该过程经历9 min后,随时间的延长,FRET效率下降.研究结果表明:在活细胞生理条件下,TGFβ1/TβRI信号转导过程存在一定的时间特异性.     

基于FRET技术MMP-9生物传感器的构建及鉴定

为了构建包含有增强青色荧光蛋白-MMP-9-黄色荧光蛋白(ECFP-MMP-9-YPet)融合蛋白的真核表达质粒MMP-9生物传感器,利用原有质粒Src biosensor和通用载体p MD-18T,通过基因工程的方法构建ECFP-MMP-9-YPet生物传感器并进行鉴定,转染293T细胞24 h后观察转染效率,然后加MMP-3刺激293T细胞,运用荧光共振能量转移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技术在荧光显微镜下观察MMP-9生物传感器的荧光共振能量转移现象。PCR和双酶切鉴定显示,ECFP-MMP-9-YPet生物传感器构建成功,293T细胞转染效率约40%。用免疫荧光法检测MMP-9生物传感器融合蛋白在293T细胞表面膜表达,用MMP-3刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结果表明,基于FRET构建的MMP-9生物传感器可以敏感而准确地监测活细胞中MMP-9的表达情况。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

藏红花酸对TGF-β1刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响

目的:研究藏红花酸(crocetin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响。方法:体外培养LX-2细胞,随机设立空白对照组,模型组,藏红花酸低剂量组,藏红花酸中剂量组,藏红花酸高剂量组,用含10%血清的1640培养液培养48 h,MTT法测各组细胞增殖,蛋白免疫印迹测定各组细胞α-SMA蛋白的表达,实时荧光定量PCR法测各组细胞Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达。结果:与对照组比较,TGF-β1刺激后人肝星状细胞LX-2增殖作用明显,且上调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,下调Smad7mRNA表达(P0.01)与模型组比较,藏红花酸组均能抑制LX-2细胞增殖,并呈剂量依赖性,高、中剂量组作用明显,能够明显下调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,上调Smad7mRNA表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:藏红花酸对TGF-β1刺激的LX-2细胞中Smad7mRNA具有上调作用,对Smad2、Smad3mRNA具有下调作用,其抗肝纤维化作用可能与抑制TGF-β1/Smads信号转导通路有关。     

RNA干扰对Smad7基因的抑制作用

小分子干扰RNA(siRNAs)可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解,称为RNA干扰(RNAi)。本研究旨在探讨Smad7基因的siRNAs是否能抑制基因的表达。利用RNA干扰技术,设计并合成了针对Smad7基因的siRNAs,用脂质体转染法瞬时转染BEP2D和BERP35T2细胞,用Northern blot法检测RNAi效应;同时设计并合成了绿色荧光蛋白(GFP)的siRNAs,瞬时转染稳定表达绿色荧光蛋白的BERP35T2细胞,检测荧光强度有无改变。结果表明RNA干扰技术能明显抑制Smad7基因的表达,并能显减弱绿色荧光的表达强度,为进一步研究Smad7基因功能及TGF-β信号转导通路奠定了基础。     

Smad7基因的克隆、表达及对c-myc基因的调控

Smad7是TGr-β家族信号转导通路的抑制分子,可反馈调节TGF-β／Smads信号转导通路,从功能推测,Smad7表达紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性化进展,为了深入探讨Smad7基因功能,通过设计引物,用Touchdown巢式．PCR法从人胎脑文库中扩增Smad7基因编码区全长,回收产物,克隆并构建真核表达载体,同融合有报告基因的c-myc顺式增强子元件共转染BEP2D细胞,结果表明：TGF—p可抑制c．myc报告基因的活性,Smad7基因可正调控c．myc报告基因的表达,并拮抗TGF．B对该基因的抑制作用．由此得出结论：Smad7基因通过桔抗TGF．B来调控c．myc基因、     

Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用.培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Western blot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异.结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显受到抑制.表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.     

利用荧光生物感受器研究p38MAPK的生物活性

[目的]观察生理状态下人骨肉瘤细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPKs)被磷酸化的过程。[方法]先进行ECFP-p38MAPK-Citrine(p38MAPK biosensor)融合蛋白表达载体的构建及鉴定,然后转染MG-63细胞24h后观察转染效率和融合蛋白表达情况。在荧光显微镜下,应用Meta Flour FRET 4.6软件测量转化生长因子-β1刺激MG-63细胞前后p38MAPK biosensor的荧光能量共振转移的变化情况。[结果]p38MAPK biosensor转染效率达30%~40%,均匀分布在胞质和胞核中。转化生长因子-β1刺激MG-63细胞后,胞质和胞核内荧光能量共振转移比值(Citrine/CFP)迅速增高,历时约30min达到最大值。特异性p38MAPK抑制剂SB-203580与细胞共孵育后,FRET比值逐渐减小。[结论]应用荧光能量共振转移技术使我们在活细胞生理状态下,实时动态监测p38MAPK被磷酸化的时空信息。     

Smad4基因在人卵巢癌高、低转移细胞系HO-8910和HO-8910PM中的表达及其对肿瘤转移作用的研究

转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）超家族广泛存在于多种生物的各种组织中,参与细胞增殖分化、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成等多种生物学事件。Smad4是TGF-t3／Smads信号通路中的关键分子,研究表明,Smad4的过表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和细胞外基质的合成并诱导凋亡。本实验利用人高低转移性卵巢癌细胞系HO-8910PM和HO-8910细胞系作为对象通过基因转染技术过表达Smad4,     

人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达

目的:构建人神经生长因子信号肽与人β-内啡肽融合基因的真核表达载体,研究人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达.方法:取得人基因组后,PCR 法获取人的神经生长因子信号肽部分序列及人β-内啡肽序列;通过 SOE-PCR法将两段 DNA 序列连接,然后插入到真核表达载体内,测序正确后扩增转染级的真核表达载体.表达载体脂质体法转染 NIH3T3细胞,转染后 48-72h 收集细胞及培养上清,RT-PCR 法检测融合基因的转录.RIA 法测定细胞外β-内啡肽的浓度.结果:成功构建全人源的分泌型表达β-内啡肽的真核表达载体,DNA 序列经测序完全符合实验设计;融合基因能够顺利地得到转录并进行表达翻译,在细胞培养上清中可检测到其产物.结论:构建的真核表达载体能够分泌表达人β-内啡肽,提示人神经生长因子信号肽序列能够发挥其介导蛋白产物分泌表达的作用.     

监测活细胞中诱导激活的Rac、Cdc42信号转导通路的FRET单分子探针

Rho家族鸟苷三磷酸酶,包括Rac1和Cdc42等．参与调节细胞形态、细胞迁移、转录激活和基因表达等一系列细胞过程。根据FRET（Fluorescent resonance energy transfer）技术原理,构建了包含红色荧光蛋白dsRed1与青色荧光蛋白ECFP的全长cDNA．效应分子Pak1或N—WASP的GTP酶联结区域．信号分子Rac1或Cdc42的全长cDNA的几种单分子探针。转染NIH3T3或Hela细胞,以胰岛素、缓激肽为诱导剂,分别激活Rac1、Cdc42信号转导通路。离体荧光光谱检测表明．在两种转染动物细胞中均产生了FRET现象。不同信号转导通路的FRET效率,在诱导激活5min后,均达到最高值,但增加幅度有显著差异。随着诱导时间的延长,FRET效率下降,但下降速率在不同信号转导通路间差异显著。Rac1、Cdc42激活试验证实．诱导激活的转染细胞中,Rac1、Cdc42均处于激活状态（GTP—bound）,其在不同诱导时间的相对激活程度与FRET效率表现相同。诱导激活的Rac1、Cdc42信号转导通路,分别导致了转染活细胞中片状伪足、线状伪足的产生。这表明,采用这些单分子探针,可直接监测激活的信号转导通路,在活细胞中的3D时空分布变化图像及其产生的细胞学效应。采用这些单分子探针．分析、判断了一些调节蛋白对Rac1、Cdc42的GEF或GAP特性。从而提供一种可大大简化现有的鉴定待测蛋白分子的方法。     

MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluoreseeneeprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位.方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布.结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点.pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达.结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达.     

RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

Smad蛋白家族是TGF-β/Smad信号通路中的重要成员,其中Smad4在该信号转导途径中起着关键作用。本研究利用RNAi技术沉默Smad4基因,探讨其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。设计并合成靶向Smad4的小分子干扰RNA,在脂质体的介导下转染猪卵巢颗粒细胞,荧光定量PCR检测Smad4 mRNA的表达情况;MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测细胞活性;TUNEL(原位末端核苷酸标记法)及Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA表达水平。研究显示,Smad4-siRNA能有效抑制Smad4的mRNA表达(P0.01),细胞活性由0.31减少到0.27,凋亡率由17.0%增加到22.1%,Bcl-2的mRNA表达显著下调。结果说明沉默Smad4基因可以促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡,其机制可能与调控Bcl-2表达有关。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

利用寡核苷酸芯片分析Smad3基因敲除小鼠关节软骨细胞基因表达谱的改变

此前发现 Smad3 基因敲除小鼠(Smad3ex8/ex8)的关节软骨细胞异常肥大分化,出现类似于人类骨关节炎的表型。为了进一步明确转化生长因子-β(TGF-β)/Smad3 信号通过调节哪些靶基因的表达来抑制关节软骨细胞的肥大分化,以及研究骨关节炎发病的分子机制,利用寡核苷酸芯片技术分析了 5 日龄 Smad3 基因敲除小鼠与野生型对照小鼠关节软骨细胞基因表达谱的改变。通过对差异表达基因的分析,发现在 Smad3 基因敲除小鼠软骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)与 TGF-β/细胞分裂周期基因 42(Cdc42)信号通路活性增强。此外,还发现其他信号通路,如生长激素(growth hormone)/胰岛素样生长因子 1(Igf1)以及成纤维细胞生长因子(Fgf)信号通路相关基因表达的改变。值得注意的是,还发现了 Smad3 基因敲除小鼠软骨细胞中蛋白合成与电子传递链相关基因的表达水平普遍上调,这意味着蛋白质合成速率的加快与细胞有氧呼吸的增强可能与关节软骨细胞的肥大分化和骨关节炎的发生相关。     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

鸡贫血病毒VP3蛋白序列与其核定位功能的相关性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus, CAV）编码一种小蛋白VP3.通过构建vp3基因与绿色荧光蛋白基因的真核融合表达载体,转染5种肿瘤/转化细胞株, 观察绿色荧光在亚细胞区域的定位,证实VP3具有核定位的功能;分析VP3的氨基酸序列,将其具核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）特征的区域删除,再构建此缺失的VP3的基因与绿色荧光蛋白基因的真核融合表达载体、转染实验显示核定位现象消失;进一步将具核定位序列特征的区域亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体上,核定位功能再现.从而推断这一区域是VP3蛋白核定位的功能区.此区域位于VP3的C端,且富含碱性氨基酸,二级结构预测发现这一区域形成特定的β折叠结构.用碘丙锭(propidium iodide, PI)染色的方法还得到了VP3促进肿瘤细胞凋亡的初步证据.     

亚油酸调控HepG2细胞PAI-1基因表达的机制研究

目的：探讨亚油酸对HepG2细胞PAI-1基因表达的影响和调控机制。方法：不同浓度亚油酸刺激HepG2细胞,RT-PCR法检测PAI-1 mRNA水平。构建四个含PAI-1启动子序列从-804至＋17间系列缺失体片段驱动的荧光素酶报告基因质粒,转染HepG2细胞,初步确定位于PAI-1启动子序列-804至＋17之间的Smad3/4结合元件（SBE）具有调控作用,采用重叠PCR法对该元件进行定点突变并构建相应重组质粒,转染HepG2细胞。WesternBlot法检测亚油酸诱导下HepG2细胞中Smad3和Smad4的蛋白表达水平。结果：①50μmol/L及100μmol/L亚油酸可显著增加PAI-1 mRNA的表达,100μmol/L亚油酸可明显上调PAI-1的转录活性。②亚油酸诱导下,PAI-1启动子-734/-731处SBE缺失后,PAI-1荧光素酶活性显著降低。③亚油酸可以显著增加HepG2细胞中Smad3和Smad4的蛋白表达。结论：亚油酸可从转录水平上调HepG2细胞中PAI-1基因的表达,PAI-1启动子上的Smad3/4结合元件即SBE参与亚油酸对HepG2细胞PAI-1基因的转录调控,这一过程涉及到Smads蛋白及其介导的Smad信号转导通路。     

RNA干扰沉默Smad3对人肺成纤维细胞Ⅰ型胶原产生的影响

目的:转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)通过Smad3(drosophila mothers against decapentaplegic)依赖的细胞因子信号转导通路,促进I型胶原的合成和分泌,在哮喘气道重塑中起重要作用.近年来RAN干扰技术在基因治疗及功能研究取得很大进步,本实验探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Smad基因表达对人肺成纤维细胞(human lung fibroblast-1,HLF-1)合成I型胶原的影响.方法:设计并合成Smad3特异性小发卡干扰RNA(short hairpin RNAs,shRNA),用脂质体转染入培养的人HLF-1细胞,反转录聚合酶链反应(reverse transfection PCR,RT-PCR)法和蛋白质印迹(Western blot)法观察基因沉默效果,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)检测RNA干扰对人HLF-1细胞合成I型胶原的影响.结果:shRNA-Smad3成功转染入人HLF-1细胞并有效沉默Smad3的表达,RT-PCR结果显示shRNA-Smad3转染后Smad3mRNA表达与正常对照组和阴性对照组比较,分别降低68.2％和69.5％,差异有统计学意义(P＜0.05);Westem blot结果显示shRNA-Smad3转染后Smad3蛋白表达与正常对照组正常对照组和阴性对照组比较,分别降低了67.1％和64.7％,差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测结果显示shRNA-Smad3转染后I型胶原为正常对照组和阴性对照组的59.3％和61.1％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:shRNA-Smad3能有效沉默HLF-1细胞中Smad3 mRNA和Smad3蛋白的表达,并减少HLF-1细胞I型胶原的合成.为进一步应用干扰RNA技术治疗哮喘患者气道重塑提供新的思路.     

Smad4介导转化生长因子-β信号调节骨骼发育和稳态维持的功能

转化生长因子-β（TGF-β）是一个包括数十种TGF-βs、骨形态发生蛋白（BMPs）等配体在内的生长因子超家族,在哺乳动物整体和组织器官发育过程中具有广泛而重要的功能。Smad4是细胞内TGF-β信号通路的核心信号转导分子。为了深入研究Smad4介导的TGF-β信号在骨骼发育过程中的生理功能,我们利用转基因技术研制了软骨细胞、肥大型软骨细胞和成骨细胞分别特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,利用条件基因敲除技术研制了不同类型骨骼细胞Smad4基因敲除的小鼠模型。表型分析结果揭示了Smad4在软骨细胞增殖和分化、骨重塑以及稳态维持过程中的功能以及相关的分子机制,为理解人类相关骨骼疾病的发生及其机理提供了新的线索。