Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用.培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Western blot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异.结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显受到抑制.表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.     

Smad4分子在ERK/MAPK信号转导通路中的作用

为了探讨在人永生化支气管上皮细胞BEP2D细胞中,Smad4分子对 ERK/MAPK通路的作用,我们用RNA干扰的方法分别设计了两对Smad4 siRNA,并使BEP2D细胞中Smad4靶向沉默,用Western印迹分析了细胞内ERK激酶和MEK激酶磷酸化水平的变化.结果发现,当Smad4表达沉默后,ERK激酶磷酸化水平未变,MEK激酶磷酸化水平有所降低;再加TGF-β1诱导后ERK激酶和MEK激酶磷酸化水平均显著降低至基础水平以下.结果表明在BEP2D细胞中,Smad4的缺失抑制TGF-β1对ERK/MAPK通路的活化,故提出TGF β活化ERK/MAPK通路需要Smad4存在的假设.     

RNA干扰对Smad7基因的抑制作用

小分子干扰RNA(siRNAs)可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解,称为RNA干扰(RNAi)。本研究旨在探讨Smad7基因的siRNAs是否能抑制基因的表达。利用RNA干扰技术,设计并合成了针对Smad7基因的siRNAs,用脂质体转染法瞬时转染BEP2D和BERP35T2细胞,用Northern blot法检测RNAi效应;同时设计并合成了绿色荧光蛋白(GFP)的siRNAs,瞬时转染稳定表达绿色荧光蛋白的BERP35T2细胞,检测荧光强度有无改变。结果表明RNA干扰技术能明显抑制Smad7基因的表达,并能显减弱绿色荧光的表达强度,为进一步研究Smad7基因功能及TGF-β信号转导通路奠定了基础。