家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕（Bombyx mori）线粒体基因组3468bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶一段序列,根据序列同源性比较,该DNA片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因5′端399bp的序列,以及6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNA^Met基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%,COⅠ基因的同源性约83.8%,COⅡ基因5′端的同源性约80％,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺漂呤二核苷酸脱氢酶基因保守,6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大,另外,除tRNA^Chn基因的二级结构相似外,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。     

家鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ）基因的克隆及序列分析

线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器,是细胞进行氧化磷酸化的场所。不同脊椎动物同源基因序列的比较显示,细胞色素b(Cytb)、细胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）、细胞色素C氧化酶Ⅱ（COⅡ）、细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ） 基因最保守,同源性最高,ATPase6、ATPase8基因、ND基因变异比较大。本试验以家鸭（家鸭起源于绿头鸭：Anas platyrhynchos）肝脏的线粒体DNA为模板,按照GenBank已经公布的潜鸭族（AF090337）的全序列及其绿头鸭的mtDNA部分序列（L22476、L16770、L22477）设计合成特异引物进行PCR扩增,克隆并测定了线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ亚基（COⅢ）的全序列784bp以及ATPase6基因的3'端和tRNA-Gly基因的5'端序列共934bp。 用DNAStar分析软件对家鸭与GenBank中7种禽类的COⅢ序列进行比较分析,显示家鸭与这些动物的COⅢ基因具有较高的同源性,与同科潜鸭属中的Aythya Americana的相似性 最高为90.6 %,与同目不同科的加拿大雁、小天鹅、白额雁的相似性分别为89%、88.6%、88.6%。根据家鸭与其他7种禽类的COⅢ基因序列相似性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。     

桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。     

基于形态和分子数据的山东梨园新成灾害螨柑橘全爪螨的鉴定

【目的】本研究旨在准确鉴定山东梨园一种新成灾害螨,为其进一步研究和有效防控奠定基础。【方法】采用体视显微镜直接观察雌成螨的形态特征,制作雄成螨的侧面观玻片标本,观察其阳茎形态特征,进行形态鉴定。从单头雌成螨中提取基因组总DNA,以螨类特异性引物扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ, COⅠ)基因及核糖体DNA第一内转录间隔区(internal transcribed spacer 1, ITS1)和第二内转录间隔区(internal transcribed spacer 2, ITS2)基因并测序,所得序列在NCBI网站上进行Blastn比对,下载与其一致性高的相关基因序列构建系统发育树和计算遗传距离,进行分子鉴定。【结果】结果表明,梨树上害螨的雌成螨背部有粗大突起,可确定为全爪螨属Panonychus害螨。雄螨阳茎特征与柑橘全爪螨Panonychus citri的很相似,其COⅠ, ITS1和ITS2基因序列均与柑橘全爪螨的相应序列具有很高的同源性(核苷酸序列一致性在99%以上),基于COⅠ, ITS1和ITS2基因序列计算的其与柑橘...     

线粒体DNA序列在半翅目异翅亚目昆虫分子系统学上的应用

随着PCR技术的发展以及大量DNA序列的累积,昆虫分子系统学近年来快速发展。线粒体DNA(mtDNA)序列相对于核内DNA序列进化速率较快,常被用于昆虫的系统发育研究。本文综述了国内外学者利用各种线粒体DNA序列来研究半翅目异翅亚目昆虫系统发育的研究概况。总结发现,COⅠ、COⅡ、12S rDNA、16S rDNA、Cytb、ND1、ND2和ND5等线粒体区段被用于半翅目异翅亚目系统发育的研究,其中以COI、COⅡ、16S rDNA和Cytb应用最广泛,但目前尚缺乏不同分子标记间的联合分析。进一步的研究最好在选定半翅目异翅亚目昆虫的分类阶元(如科间、亚科间、科内属间、种间或种内)后,集中测定线粒体某几个区段的DNA序列,然后进行单一分析和联合分析,并与传统形态学研究结果进行比较,可望全面分析半翅目异翅亚目昆虫的系统发育关系。     

Establishment and application of DNA barcoding technology for identification of the immatures and adult debris of Bactrocera dorsalis (Hendel) ( Diptera: Tephritidae)

实蝇类害虫多为国内外检疫对象,其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征,而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体,则无能为力.本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体(卵、幼虫、蛹)以及成虫残体(足、翅、头部、胸部、腹部)为对象,利用DNA条形码技术,构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系,并以其他4种常见实蝇(包括番石榴实蝇B.correcta、瓜实蝇B.cucurbitae、南亚果实蝇B.tau、柑桔大实蝇B.minax)为对象对该技术体系进行应用验证.结果显示,桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种CO Ⅰ基因碱基序列的一致性为99.51％～99.84％,其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种CO Ⅰ基因序列的一致性分别为100％,100％,99.81％～ 99.83％和100％;以邻接法(NJ法)构建系统发育树,靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支,且置信度均为100％.以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出,5种实蝇的种间遗传距离为0.0597～0.2363,平均为0.1693;种内遗传距离为0.0000 ～0.0041,平均为0.0019.这些结果表明,基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定.     

轮虫同域性物种形成:来自萼花臂尾轮虫克隆间的分子系统发育关系和生殖隔离的证据

对采自芜湖市三个不同水体中的萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)17个克隆的线粒体COⅠ基因和rDNAITS1序列进行的分析结果表明:萼花臂尾轮虫不同克隆间COⅠ基因序列差异百分比为0-14.0%,平均为5.1%;ITS1序列差异百分比为0-7.4%,平均为2.2%。基于COⅠ基因序列构建的分子系统树(NJ树、MP树、ML树和贝叶斯树)均支持将17个克隆划分为三个姐妹种,各姐妹种间的序列差异百分比为7.2%-14.0%。基于ITS1序列构建的同样四种分子系统树也支持将17个克隆划分为三个姐妹种,但其中的克隆HE5在姐妹种中的归属与基于COⅠ基因序列构建的分子系统树所得出的结果不同,各姐妹种间的序列差异百分比为1.9%-7.4%。混交雌体和雄体间的交配实验结果表明,轮虫各姐妹种间存在着明显的生殖隔离,克隆HE5在姐妹种中的归属应与基于COⅠ基因序列构建的分子系统树所得出的结果一致;ITS1序列进化速率较低,不宜用于轮虫姐妹种的准确甄别。COⅠ基因进化钟计算结果显示,三个姐妹种间,克隆LE9所属的姐妹种早在8百万年前便分化形成出来,HE1、HE2、HE4-7所属的姐妹种于5百万年前分化产生。     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

孟加拉笛鲷线粒体基因组序列结构及其进化

采用Long-PCR扩增线粒体全基因组方法得到了孟加拉笛鲷线粒体基因组全序列.序列分析结果表明,孟加拉笛鲷线粒体基因组序列全长16 511 bp,共有13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个D-loop区.在编码蛋白质基因中,除COⅠ是以GTG作为起始密码子外,其它均是以ATG起始,NDⅠ、COⅡ、ND3以TAG作为终止密码子,而ND4、Cyt b则以不完全的T为终止密码子,其余8个蛋白质基因的终止密码子均为TAA.孟加拉笛鲷线粒体基因组各基因长度、位置与典型的脊椎动物相似,其编码蛋白质基因和rRNA基因与其它硬骨鱼类具有很高的同源性.基于14种笛鲷线粒体区段COⅠ、COⅡ和Cyt b基因的全序列合并成的一个组合数据集构建系统进化树,显示孟加拉笛鲷与四带笛鲷关系最为密切.     

基于基因组特异性SSR序列的实蝇PCR鉴定方法

【目的】实蝇科昆虫是全球范围内重要的检疫性害虫,其幼虫取食寄主果实,引起果实腐烂、变质,造成巨大经济损失。由于口岸截获多为实蝇卵、幼虫、蛹等非成虫虫态,需饲养至成虫才能根据形态准确鉴定,因此快速可靠的分子鉴定技术体系亟需完善。【方法】利用公开发表的实蝇基因组序列,通过生物信息学方法从4种检疫性实蝇即地中海实蝇Ceratitis capitata、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、昆士兰实蝇Bactrocera tryoni中挖掘物种特异性的简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR),针对各物种设计含有其特异性简单重复序列的引物,提取实蝇样品基因组DNA,采用常规PCR方法优化并筛选各物种特异性引物。【结果】在4种实蝇基因组中共发现20条物种特异性的SSR,基于这些序列设计的3对特异性引物能有效区分地中海实蝇、瓜实蝇和橘小实蝇,扩增片段大小分别为1 251、1 307、823 bp,而在其他物种中检测不到条带。【结论】基因组水平的序列分析发现了物种特异性的SSR,通过筛选获得物种特异性的PCR引物,可应用于3种实蝇的分子鉴定,为口岸检疫人员快速鉴定区分非成虫状态的实蝇提供了实用性技术。     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

中华雏蝗（Chorthippus chinensis Tarb）线粒体基因组分析

采用Lon-PCR扩增线粒体全基因组和保守引物步移法结合克隆方法测定并拼接获得了中华雏蝗（Chorthippus chinensis Tarb）线粒体基因组全序列．序列的注释和分析结果表 明,中华雏蝗线粒体基因组序列全长15 599 bp,共有13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个A+T富集区．基因顺序与非洲飞蝗（Locusta migratoria）相同,也发生了2个 tRNA Asp(D)和tRNALys(K)的倒置．13个编码蛋白质基因都使用了ATN作为起始密码子．除ND1以TAG和ND5的终止密码子为不完全的T外,其余11个编码蛋白质基因的终止密码子都为完整的TAA．6种直翅类昆虫13个蛋白质的氨基酸序列的联合数据集构建的系统树与形态分类系统一致,中华雏蝗与非洲飞蝗为姐妹群,并与东方蝼蛄构成一单系群．     

背瘤丽蚌F型线粒体基因组全序列分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式是特殊的双重单亲遗传方式:F型存在于雌性体细胞组织和性腺中,M型仅存在于雄性个体的性腺中。通过LA-PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接获得背瘤丽蚌(Lamprotula leai)F型线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为16530 bp,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA其中包括2个tRNA^Ser和2个tRNA^Leu,2个SrRNA及27个长度不等的非编码区,最长的两个非编码区分别为969 bp、228 bp。比较分析已登录到GenBank中的淡水蚌类F型线粒体结构特征,结果显示背瘤丽蚌F型A+T含量为60.28%,表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现为非编码区长度的差异。此外,背瘤丽蚌mtDNA的COⅡ-12S rRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNA^His、tRNA^Ala、tRNA^Ser1、tRNA^Ser2、tRNA^Glu、ND2、tRNA^Met 8个基因发生重排造成。F型线粒体序列构建的系统进化树中,淡水蚌类和海水双壳贝类分别聚为一支。研究结果为进一步研究淡水珍珠蚌的DUI线粒体遗传方式和种质资源保护奠定基础,为双壳贝类mtDNA基因重排提供依据。     

华北地区中华蒙潮虫(甲壳动物亚门:等足目)种群遗传多样性研究

中华蒙潮虫Mongoloniscus sinensis(Dollfus,1901)隶属于甲壳动物亚门Crustacea等足目Isopoda潮虫亚目Oniscidea,中国特有种。为了探究中华蒙潮虫的种群遗传分化和系统进化关系,采用PCR对采自华北地区10个地理种群89只个体线粒体2个基因COⅠ和ND5进行联合分析。结果表明:1)中华蒙潮虫COⅠ部分基因长604 bp,ND5部分基因长615 bp,拼接序列长1 219 bp,T、C、A和G含量分别为41.0%、11.2%、30.8%和17.0%,具有显著的A+T偏倚;变异位点503个(占总核苷酸序列的41.3%),序列间的转换/颠换比值为2.8。2)89只个体共45种单倍型,单倍型多样性0.964,核苷酸多样性0.005 6,整体遗传多样性水平中等;单倍型H1、H15、H16、H21、H41为2～3个种群共享单倍型。3)联合基因(COⅠ+ND5)系统发育树表明,最早出现的是华北以北地区(山西大同、河北石家庄),最晚分化出的是华北以南地区(山西临汾、陕西西安未央区、河南新乡),演化路线为从北向南,个别种群单倍型未按地理来源形成明显的簇群。4)平均遗传分化指数为0.513,基因流为0.24;分子变异分析结果表明,种群的变异与分化主要来自种群内部,错配分布呈多峰,结合中性检验(Tajima's D=-1.429;Fu's F_s=6.499),发现中华蒙潮虫近期未经历扩张,但种群内部分化显著,增长平稳。本研究首次基于线粒体多基因联合分析了中华蒙潮虫种群遗传多样性。     

大亚基rRNA基因D1/D2区序列相同或相似的子囊菌酵母ITS序列比较和核型分析

下面每个组内的酵母菌:I)Candida aaseri和Candida butyri;Ⅱ)Candida boleticola, Candida laureliae和Candida ralunensis;Ⅲ) Candida zeylanoides和Candida krissii以及Ⅳ) Pichia farinosa和Candida cacaoi因具有相同或只有一个碱基差异的大亚基(26S)rRNA基因D1/D2区序列,而被认为属于同一个种。本研究对其ITS序列和电泳核型进行了比较分析。结果表明前3个组内的种具有完全相同的ITS序列,第Ⅳ组的两个种只有1个碱基差异, 但是各组内的核型并不完全一致。第Ⅳ组内的两个种具有完全相同的核型,证实他们属于同一个种。第Ⅱ组内的C.laureliae和C.ralunensis也具有完全相同的核型,可以肯定二者也属于同一个种,该组内的C.boleticola的核型与前二者不完全一样,但染色体分子量范围相似,也可能与前二者属于同一个种。第Ⅰ和Ⅲ组内各种的核型具有明显差异,对组内种间的同物异名关系未提供支持。     

高GC含量的鳜鱼rRNA基因家族的克隆

动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。     

Balb/c小鼠增龄过程中不同脏器线粒体DNA损伤及损伤修复相关基因的变化

为探讨Balb/c小鼠增龄过程中线粒体DNA损伤及其修复基因表达与衰老之间的关系,采用逆转录 多聚酶链反应（RT PCR）方法,检测年轻与老年Balb/c小鼠脑、肝脏和脾脏中线粒体自身编码基因细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ基因（coⅠ）和细胞色素氧化酶亚单位Ⅲ基因（coⅢ）及8 氧鸟嘌呤糖基化酶基因（ogg1）、DNA聚合酶γ（DNA polymeraseγ）基因、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶基因（nth1）等碱基切除修复基因在mRNA水平的变化.用Western印迹方法检测小鼠脾脏中COⅢ和OGG1的蛋白质水平的变化.结果发现,老年小鼠脾脏中coⅠ和coⅢ的mRNA水平比年轻小鼠显著增加（P<0.05）,CO Ⅲ的蛋白质水平亦比年轻小鼠显著升高（P<0.05）;老年小鼠脾脏OGG1的mRNA和蛋白水平上均比年轻小鼠显著增加（P<0.05）.老年小鼠肝脏和脾脏DNA聚合酶γ和NTH1的mRNA水平比年轻小鼠显著升高（P<0.05）.提示线粒体DNA自身编码的基因及碱基切除修复基因的表达失衡可能是Balb/c小鼠衰老的原因之     

Complete mitochondrial genome of the boreal digging frog Kaloula borealis (Anura, Microhylidae)

We sequenced the complete mitochondrial genome from the boreal digging frog Kaloula borealis. The genome sequence was 17,173 bp in size, and the gene order and contents were identical to those of previously reported amphibian mitochondrial genomes. Of 13 protein-coding genes (PCGs), 5 genes (CO2, ATPase 6, CO3, ND3, and ND4) had incomplete stop codons. Also ND1 gene used GTG as a start codon, while CO1 and ND5 genes used AGG as a stop codon. The base composition of K. borealis mitogenome showed a strong anti-G bias (6.11%) on the 3rd position of PCGs.