黄河裸裂尻鱼肥胖基因克隆及其对青藏高原季节性冷环境的适应性表达

目的克隆黄河裸裂尻鱼肥胖基因(obese gene,ob),分析编码蛋白leptin的序列特征,检测ob mR-NA的组织特异性表达和不同环境温度下肝胰脏和白肌ob mRNA的相对表达水平,为探究黄河裸裂尻鱼在青藏高原季节性寒冷环境下的生态适应机制提供科学数据。方法利用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得ob基因全长cDNA序列。通过已知cDNA序列设计半定量RT-PCR和real-time PCR引物,进行表达研究。结果黄河裸裂尻鱼ob基因序列全长为1 337 bp,其中开放阅读框(ORF)长513 bp,编码170个氨基酸。黄河裸裂尻鱼ob mRNA在心脏、肾脏、脂肪、肠、精巢、肝胰脏、鳃、脑和肌肉9个被检组织中均有表达,其中在心脏中表达最强,肌肉组织中表达最弱。栖息水域环境温度下降,将显著抑制黄河裸裂尻鱼肝胰脏和白肌ob mRNA的表达。结论黄河裸裂尻鱼ob基因特殊的组织表达特征可能与其特定组织的能量代谢及其特殊的生物学功能有关。Leptin在黄河裸裂尻鱼能量代谢调节和季节性环境适应方面发挥着重要作用。     

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。     

黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。该文以黄河裸裂尻鱼肌肉总RNA为模板,采用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得MSTN基因全长cDNA序列为2180bp,包含长为1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸。以肌肉总DNA为模板,通过PCR法进一步获得了MSTN基因的2个内含子序列,分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN基因与其他脊椎动物具有相似的基因结构(包括3个外显子和2个内含子)。黄河裸裂尻鱼MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RXXR和8个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN序列与其他鲤科鱼类MSTN具有较高的同源性;而与哺乳动物和禽类的MSTN同源性较低。系统发育分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。RT-PCR分析表明,该基因在黄河裸裂尻鱼9个被检组织中均有表达,但在心、肾、肠、精巢中表达量较高。Real-TimePCR分析显示,MSTN基因在胚胎中的相对表达量,随胚胎发育阶段的不同而有所差异,暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用,可能还有其他功能。     

利用Cyt b基因序列探讨柴达木裸裂尻鱼的分类学地位

长期以来,柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)的分类学地位存在争议。为此,测定了柴达木裸裂尻鱼格尔木河及托素湖种群24个个体及黄河裸裂尻鱼(S.pylzovi)黄河及大通北川河种群12个个体的Cytb基因全序列。通过遗传距离和系统发育分析,探讨了柴达木裸裂尻鱼的分类学地位。结果显示,柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼在系统进化树上并未形成相应的单系群;柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼种间平均遗传距离为0.54%,明显低于裂腹鱼亚科其他属鱼类的种间遗传距离及本属其他种间遗传距离,表明来自柴达木盆地格尔木河和托素湖的裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼之间没有达到种级水平的显著分化。综合地质学资料和柴达木水系与黄河水系现今的隔离格局,建议将柴达木裸裂尻鱼作为黄河裸裂尻鱼的一个亚种,即S.pylzovi kessleri。     

黄河裸裂尻鱼群体遗传结构和Cyt b序列变异

测定了来自黄河上游和柴达木盆地托索湖的裸裂尻鱼共16个个体的Cytb基因全序列(1141bp),探讨了种群结构和遗传多样性。用MEGA2.1软件分析了碱基组成和序列变异;以青海湖裸鲤、花斑裸鲤和极边扁咽齿鱼为外类群,用PAUP*4.0b10程序构建了单倍型NJ树;用Arlequin Ver.2000程序计算了群体间遗传变异值(Fst)和Nm值以及群体分化概率值。结果显示,来自柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼没有形成单系群,Fst=0.204(P0.05),Nm=1.95。初步判断,黄河和柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼未显著分化,支持将柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)归并入黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)的形态学结果。两种群核苷酸多样度()分别为0.0012和0.0026,表现为较低水平。根据校正的分子钟推测,黄河和托索湖裸裂尻鱼群体分歧时间为距今7万年左右的更新世末期,结合地理分布的资料和古地质事件,对黄河裸裂尻鱼群体分布水系间的历史联系进行了分析。       

青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼感染多子小瓜虫的病理学比较研究

为探讨不同裂腹鱼类感染多子小瓜虫后的病理学差异, 利用多子小瓜虫对青海湖裸鲤指名亚种(Gymnocypris przewalskii przewalskii)和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)实施感染实验, 并对2种鱼进行了深入的病理学研究。研究结果显示: (1) 2种鱼的死亡量均呈现先激增后明显回落的趋势, 青海湖裸鲤死亡高峰在感染后第3至第4天, 黄河裸裂尻鱼死亡高峰在第3至第5天, 青海湖裸鲤的死亡比黄河裸裂尻鱼急剧。(2)感染后2种鱼体表均出现大量肉眼可见的白点。青海湖裸鲤皮肤黏液分泌量明显增加, 体表形成胶状黏液层, 黏液层中见不同细胞期小瓜虫包囊。黄河裸裂尻鱼鳍出现蛀鳍现象, 皮肤出现细菌感染样溃烂。(3)解剖发现, 感染组青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼肝脏发生病理改变呈淡黄色, 胆有不同程度肿大。(4)组织切片和电镜观察显示, 小瓜虫在鳃部位的寄生导致青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼鳃丝黏连, 鳃小片和鳃丝上皮细胞萎缩、脱落, 鳃丝结构被严重破坏。小瓜虫在2种鱼皮肤的寄生使寄生部位组织突起, 周围组织塌陷。青海湖裸鲤表皮下层出现空隙, 表皮结构被严重破坏。黄河裸裂尻鱼皮肤表皮细胞出现空泡化病理改变, 失去原有紧密结构, 表皮层和固有层间界限变模糊。综上所述, 小瓜虫的感染对青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼的鳃和皮肤组织造成严重损伤, 但2种鱼表现的症状和造成的组织损伤类型有明显差异, 这与2种鱼长期适应不同水体环境密切相关。     

黄河裸裂尻鱼MSTN基因RNA干扰研究

目的利用反义寡合甘酸技术抑制肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)的表达,评估MSTN基因的沉默效果,并检测RNA干扰后对下游基因的影响。方法通过构建黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)MSTN基因RNA干扰(RNAi)重组腺病毒载体1P3(DSP MSTN 273+250+1737)和1P2(DSP MSTN 195+1670),并将其注射黄河裸裂尻鱼肌肉组织,进行活体RNA干扰;利用real-time PCR和Western blotting评估MSTN基因的沉默效果,并检测MSTN基因RNA干扰后肌肉肌酸激酶(muscle-type creatine kinase,M-CK)基因转录水平的调控作用。结果real-time PCR分析结果表明,与HK组(病毒通用阴性对照组)和N组(空白对照组)相比,重组腺病毒载体1P3对黄河裸裂尻鱼肌肉MSTN基因的转录具有明显的干扰作用(P0.05),抑制率达53.5%;而重组腺病毒载体1P2对MSTN基因的转录无明显干扰作用(P0.05)。Western-blotting分析结果与real-time PCR结果相一致。同时,经1P3干扰后随着MSTN基因转录水平的下降,其肌肉肌酸激酶M-CK基因表达水平显著上升。结论通过RNAi技术能够有效的抑制MSTN基因的表达,并能够上调M-CK基因的表达量。因此,证明了在黄河裸裂尻鱼中MSTN能够抑制M-CK的转录。揭示高原土著鱼类MSTN基因的对肌肉的生长发育起到调控作用。     

miR-139555及其靶基因PtNBC在三疣梭子蟹适应盐度胁迫中的表达调控

为研究miR-139555及其潜在靶基因PtNBC(碳酸氢钠协同转运基因)在三疣梭子蟹(Portunus tritu-berculatus)适应盐度胁迫中的表达调控分析,利用RACE技术克隆了PtNBC基因,该基因全长5308 bp,开放阅读框(ORF)3570 bp,共编码1189个氨基酸.利用RT-PCR技术分析m...     

南门峡裂腹鱼亚科鱼类形态相似种的分类学地位——形态趋同进化实例

受高原抬升所致的水系变迁及人类活动的影响,分布于南门峡河流的裂腹鱼亚科鱼类与黄河干支流种群间的基因交流受到长期限制。作为孤立小群体,探讨其分类学地位及其在小生境中的进化机制对了解青藏高原鱼类多样性和物种的形成、进化具有重要意义。本文采用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序方法获得了南门峡裂腹鱼亚科鱼类(n=29)及其近缘种(n=19)共48个个体的线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b(cytb)基因的全序列(1140bp),并以厚唇裸重鱼和尖裸鲤为外群构建了MP和Bayesian系统进化树。南门峡裂腹鱼亚科鱼类29个个体的序列经排序后,发现有100个(8·77%)多态性位点,共定义了16个单倍型,在系统进化树上分布于截然不同的两个族群中。其中5个单倍型(NMX3、6、7、13、15)与其近缘种花斑裸鲤和青海湖裸鲤形成单系群(MP99%,Bayesian98%),而其余11个单倍型(NMX1、2、4、5、8、9、10、11、12、14、16)与黄河干支流的黄河裸裂尻鱼形成另一个单系群(MP99%,Bayesian99%)。序列差异分析显示,分布于不同族群的南门峡裂腹鱼亚科鱼类之间存在较大的碱基差异(平均为7·42%),显示出种间差异水平,表明分布于南门峡河流的裂腹鱼亚科鱼类可能是花斑裸鲤和黄河裸裂尻鱼形态相似种的复合体。结合青藏高原隆升所致的气候环境变化和高原北部水系变迁的事件,推断形态趋同进化可能导致了南门峡河流裂腹鱼亚科鱼类形态相似种的共存,而小生境自然选择压力是引发适应性形态趋同进化的主要原因。     

青藏高原裸裂尻属鱼类两个疑难种的分子系统学

裸裂尻鱼属[Schizopygopsis（Steindachner）]鱼类广泛分布于青藏高原各河流上游干支流及其湖泊之中,由于其广泛的分布域和特殊的生态环境而被生物学家视为青藏高原隆升过程中淡水鱼类物种起源、进化的模式物种。然而,该属鱼类种间具有非常相似的形态特征,致使大渡软刺裸裂尻鱼（Sp．malacanthus chengi）和前腹裸裂尻鱼（Sp．anteroventris）的分类学地位一直存在争议。本文采用聚合酶链式反应（PCR）和直接测序的方法,获得了裸裂尻鱼属两个分类疑难种和5个指名种（n=17）以及5个近缘种（n=5）共23个个体的细胞色素b（Cytb）基因的全序列（1140bp）,并以同亚科的齐口裂腹鱼（Schizothorax cprenanti）作为外群构建了ML、MP和Bayesian进化树。序列差异和分子系统学分析表明,Sp．malacanthus schengi和软刺裸裂尻鱼（Sp．malacanthus）间存在较大的差异（2．06％）,两者并不聚在同一枝上;Sp．anteroventris独立成一枝,与其它指名裸裂尻鱼间显示出较大差异（4．38％-5．53％）,综合其它形态差异共同提示,Sp．mnlacanthus chengi应提升为独立种,沿用Sp．chengi的种名,而Sp．anteroventris应该是裸裂尻鱼属的一个独立种。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

柽柳(Tamarix androssowii)Tadir基因的克隆及分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了Tadir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长724bp。其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸。基因编码蛋白的分子量为19.69kD,理论等电点为6.96。疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的。该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因),ABE73781(蛋白)。实时荧光定量PCR分析结果表明,0.4mol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫后该基因表达量发生变化,其可能与柽柳的耐盐性有关。     

青岛文昌鱼铜锌超氧化物歧化酶基因特征与遗传进化分析

RT-PCR和RACE技术首次克隆了青岛文昌鱼超氧化物歧化酶基因的全长cDNA序列1 285 bp,该基因开放阅读框全长468 bp,编码155个氨基酸,有7个可与铜锌离子结合的位点,预测分子量大约为15 718.32 Da,理论等电点为5.60,编码的蛋白质不存在亚细胞定位的信号肽和跨膜结构域,属于胞内铜锌超氧化物歧化酶。系统进化分析表明文昌鱼的胞内铜锌超氧化物歧化酶位于脊椎动物大分支和无脊椎动物大分支的中间,并且更偏向于脊椎动物。     

牡丹PsCS基因的克隆及序列分析

以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa L.cv.‘Zhao Fen’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹柠檬酸合成醇(citrate synthase,CS)基因cDNA全长,命名为PsCS,GenBank登录号为HQ449568.其cDNA全长1 564 bp,包含75 bp的5’非编码区、73 bp的3 '非编码区和一个长度为1 416 bp编码471个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进化分析表明,PsCS与葡萄的亲缘关系最近,相似性达89.4％以上.     

齐口裂腹鱼CDH5基因特性及其对温和气单胞菌感染的应答

探讨齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)血管内皮黏附分子(Cadherin 5,CDH5)的基因特性。用生物信息学软件分析齐口裂腹鱼CDH5基因序列,用Real-time PCR检测CDH5基因在齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌后0 h、24 h和48 h的表达变化。获得CDH5基因全长c DNA序列,Gen Bank登录号为KT329441。该序列长4 825 bp,开放阅读框长2 313 bp,编码770个氨基酸。蛋白预测结果显示,该蛋白相对分子量为85.19 k D,等电点为5.01。存在信号肽序列,二级结构以随机卷曲、延伸链、α-螺旋为主。齐口裂腹鱼CDH5氨基酸序列与斑马鱼同源性达74%,与人的相似性为43%。CDH5在感染温和气单胞菌后在各组织中均有表达。脾脏中CDH5基因在24 h表达量显著高于0 h和48 h(P0.05)。肝脏、肾脏和肌肉中CDH5在48 h的表达量均显著高于24 h(P0.05)。心脏和肠道中CDH5基因在48 h的表达量显著高于0 h(P0.05)。CDH5基因在可能参与了齐口裂腹鱼抗温和气单胞菌感染的免疫应答,为深入研究CDH5在齐口裂腹鱼中的功能奠定基础。     

军曹鱼MHC-Ⅱβ基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,得到1161bp的军曹鱼(Rachycentron canadum)MHC-Ⅱβ全长cDNA片段。该序列包括20bp的5′末端非编码区(UTR),394bp的3′UTR及747bp的开放阅读框(ORF),编码248个氨基酸,预测其蛋白质分子量约为27.99ku,等电点为6.21。通过构建MHC-Ⅱβ氨基酸序列的系统进化树,并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类、鼠(Musmusculus)、鸡(Gallus gallus)及人类(Homo sapiens)MHC-Ⅱβ氨基酸的同源性在28.5%～77.5%之间。所推测的蛋白序列具有一些重要的特征,包括:前导肽、β1、β2和CP/TM/CYT区,保守的半胱氨酸等。Real-time PCR检测结果显示,MHC-Ⅱβ基因在正常军曹鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中,头肾表达较强,鳃、脾、肠表达程度中等,在心、脑、肌肉中表达较弱。     

牛Irak-1基因的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆提供了一种利用基因组数据库克隆新基因全长cDNA序列的策略。利用小鼠Irak-1基因编码序列(NM_008363)为种子序列进行电子克隆获得了牛Irak-1基因完整编码序列。然后,用生物信息学方法分析了该基因的结构,微卫星位点,密码子偏性和氨基酸的同源性等。结果表明:该基因cDNA全长2 645bp,无内含子,最大开放阅读框2 157bp,编码718个氨基酸,与小鼠的同源性为77%。     

玉米异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及其功能分析

以玉米嫩叶为材料,采用RT-PCR技术克隆了植物萜类物质前体生物合成过程最后一个关键酶--异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因的全长cDNA,命名为ZmlPI(GenBank登录号为AY738148),该基因cDNA全长为1 382 bp,包含1 104 bp的开放阅读框,编码367个氨基酸残基.颜色互补分析表明ZmlPI能推动工程菌XLI-Blue pTreZmlPI pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,证实ZmIPI具有典型的IPI基因的功能.     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.