基于rDNAITS序列分析莲塘湖萼花臂尾轮虫两种形态型的分类地位

轮虫的周期变形是指种群内出现的轮虫形态随时间推移而发生的周期性变化,包括轮虫个体大小的变化、轮虫后棘刺或后侧棘刺的有无及长度的变化等。广泛存在的周期变形使轮虫的分类更加复杂。利用分子标记对不同形态型轮虫的遗传分化进行研究将有助于正确认识它们的分类地位。为此,研究对采自芜湖市莲塘湖水体中萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)30个有棘刺型(Spined morphotype)的克隆(S1-S30)和18个无棘刺型(Unspined morphotype)的克隆(U1-U18)进行了rDNA ITS序列分析;以十指臂尾轮虫(B.patulus)为外群,构建了48个克隆的系统发生树(NJ、MP、ML和贝叶斯树)。结果表明,所测48个克隆共包括16个单元型。在ITS序列中,T、C、A、G碱基的平均含量分别为28.6%、18.7%、35.9%、16.8%,其中A+T含量为64.5%,C+G含量为35.5%。单元型U12与其他单元型间的序列差异百分比为26.2%-26.6%,平均为26.47%;其中,发生在ITS1、5.8S和ITS2区间的序列差异百分比分别为26.9%-27.8%、2.9%-3.5%和44.4%-45.0%,平均依次为27.27%、3.09%和44.48%。而其他单元型间平均序列差异百分比为0.41%。4个系统树均支持将48个克隆分为2个支系:无棘刺型克隆U12独成一支,无棘刺型的其余克隆与所有有棘刺型克隆构成另一支系。单元型U12与其他单元型应分别属于两个不同的姐妹种;但两种形态型并非不同的亚种或互为姐妹种,它们间的形态差异主要由表型可塑性引起。       

基于线粒体COⅠ基因序列探讨臂尾轮属的系统发生和几种轮虫的分类地位

通过对萼花臂尾轮虫、角突臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫、十指臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫和红臂尾轮虫等7种轮虫mtDNA COⅠ序列分析,并以透明囊足轮虫为外群,使用MEGA软件构建臂尾轮属轮虫系统发生树(ME树和NJ树)以探讨臂尾轮属的系统发生和该属中几个种类的分类地位.结果表明本研究所涉及的轮虫mtDNA COⅠ平均序列差异百分比为24%;在两个系统树中,淡水臂尾轮虫和海水臂尾轮虫均独立成枝;用两种方法得到的系统发生树均支持将十指臂尾轮虫作为一个独立的支系分离出来.壶状臂尾轮虫和红臂尾轮虫应属于不同的种;来自芜湖、墨西哥和美国的十指臂尾轮虫以及来自芜湖和澳大利亚的萼花臂尾轮虫应分别互为姐妹种.本研究还首次揭示了角突臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫和镰状臂尾轮虫与其它臂尾轮虫间的系统关系.     

基于rDNA ITS序列分析莲塘湖萼花臂尾轮虫种群遗传结构的季节变化

对采自芜湖市莲塘湖水体中的萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)夏季种群中的30个克隆(S1-S30)和秋季种群中的20个克隆(A1-A20)的rDNA ITS序列进行了分析;以十指臂尾轮虫B.patulus为外群,构建了50个克隆的NJ、MP和ME系统发生树。结果表明:三个系统树均支持将50个克隆分为两个支系;第一支系包括29个夏季采集的单元型(单元型S9除外)和1个秋季采集的单元型A2,第二个支系包括18个秋季采集的单元型(单元型A2除外)和1个夏季采集的单元型S9;两支系间ITS序列差异为5.1%-8.8%;它们应属于两个不同的姐妹种。夏季,莲塘湖水体中的萼花臂尾轮虫种复合体内以第一支系为主构成的姐妹种在相对丰度上占绝对优势,达29/30;而秋季则相反。上述结果表明:浅水湖泊中萼花臂尾轮虫种群密度的季节变动实际上主要在于各姐妹种相对丰度的季节变化;两姐妹种的种群遗传结构季节变化符合重叠模型。     

基于16S rDNA序列探讨十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位

通过对角突臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、剪形臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫、红臂尾轮虫、镰肜臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫和十指臂尾轮虫等十种臂尾轮虫和大肚须足轮虫的线粒体16s rDNA进行扩增和序列测序,结合Genebank 中十指臂尾轮虫的16S rDNA序列,使用MAGE软件构建了NJ(neighbor-joining method)树,使用mrbayes软件构建了贝叶斯树,探讨了十种臂尾轮虫之间的系统关系.结果表明,本研究所涉及的轮虫16S rDNA序列差异百分比均值为14.6%,可作为分子标记应用于轮虫属内种间系统关系研究;系统树均支持将十指臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫隶属于臂尾轮属;壶状臂尾轮虫和红臂尾轮虫是两个独立的种.此外,还依据16S rDNA序列变异百分比推测了十种臂尾轮虫的分化时间.     

基于28S rDNA基因序列研究十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位

通过对角突臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、剪形臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫、红臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫和十指臂尾轮虫等10种臂尾轮虫以及透明囊足轮虫、大肚须足轮虫和晶囊轮虫等其他3种轮虫的28S rDNA序列分析,使用MAGE软件构建这13种轮虫系统发生树(NJ树、ME树、UPGMA树和MP树),探讨了臂尾轮属、须足轮属、晶囊轮属和囊足轮属之间以及10种臂尾轮虫之间的系统关系.结果表明,本研究所涉及的轮虫28S rDNA序列差异百分比均值为30.15%,可作为分子标记应用于轮虫属间和属内种间系统关系研究;系统树均支持将十指臂尾轮虫作为一个独立的支系从臂尾轮属中分离出来;裂足臂尾轮虫应隶属臂尾轮属;壶状臂尾轮虫和红臂尾轮虫是两个独立的种;透明囊足轮虫与臂尾轮属亲缘关系较近.     

萼花臂尾轮虫种复合体内三个姐妹种的形态差异

应用单因子方差分析和判别分析方法,分别比较了采自芜湖市3个自然水体的萼花臂尾轮虫种复合体内3个姐妹种(分别以克隆HE1和HE5、克隆HE3和SE1、克隆LE9为代表)的成体和幼体的形态差异。结果表明,克隆HE3成体的各形态参数均最小,而克隆HE1和LE9成体的各形态参数间无显著的差异;克隆HE1和HE3幼体的前中棘刺间距离和后侧棘刺长度、克隆LE9和HE1幼体的前侧棘刺间距离以及前中棘刺和侧棘刺间距离均无显著性差异,轮虫幼体的其它形态参数均以克隆LE9最长,克隆HE1次之,克隆HE3最短。对克隆HE1、HE3和LE9幼体有明显差异的形态参数所作的分布图显示,它们的分布区有很高程度的重叠。以判别分析建立的判别函数对3姐妹种成体的综合判别率中形态分析Ⅰ为47.8%,形态分析Ⅱ为55.6%;对3姐妹种幼体的综合判别率中形态分析Ⅰ和Ⅱ均为71.1%;两种形态分析对克隆HE1判别准确率均较低,分别为0-76.7%和0-74.2%;依据形态特征无法准确甄别萼花臂尾轮虫姐妹种。     

单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基部分序列测定

通过调整试剂剂量及实验条件与步骤 ,利用WizardTM基因组DNA纯化试剂盒可以稳定、快捷地提取单只轮虫的DNA。以提取的DNA为模板 ,利用COⅠ通用引物 ,扩增并测定了萼花臂尾轮虫 (Brachionuscalyci florus)COⅠ部分基因的序列。与褶皱臂尾轮虫 (B plicatilis)COⅠ基因序列比较结果表明 ,此片断确为轮虫COⅠ基因片断 ,从而证明使用本方法所提取单只轮虫痕量DNA的可靠性     

基于rDNA ITS序列探讨粉煤灰污染对萼花臂尾轮虫种群遗传多样性的影响

本文通过rDNA ITS序列测定和分析, 比较研究了粉煤灰污染水体(灰湖)与未污染水体(凤鸣湖和汀棠湖)萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)的种群遗传多样性。结果表明, 灰湖萼花臂尾轮虫仅有1个姐妹种, 而两对照湖泊均存在2个姐妹种, 粉煤灰污染使萼花臂尾轮虫种复合体内姐妹种数量减少。就三个湖泊共有的姐妹种I而言, 灰湖轮虫种群单倍型多样性最低(h= 0.9516), 核苷酸多样性(π = 0.0066)低于汀棠湖(π = 0.0073)却高于凤鸣湖种群(π = 0.0052), 粉煤灰污染对萼花臂尾轮虫种群遗传多样性表现出一定的破坏作用; 凤鸣湖轮虫种群核苷酸多样性最低, 可能是由于水体中晶囊轮虫(Asplanchna)和桡足类动物捕食压力较高以及周围农田污染的联合作用造成的。三湖泊间, 仅汀棠湖与凤鸣湖轮虫种群间基因交流值较低(N_m = 1.95), 种群分化指数较高(F_st = 0.11358); 而灰湖与汀棠湖以及灰湖与凤鸣湖轮虫种群间基因交流水平较高(N_m均大于4), 种群分化指数较低(F_st分别为0.03535和0.00276)。AMOVA分析显示汀棠湖与凤鸣湖轮虫种群间变异所占比例较高, 为12.87%; 而灰湖与汀棠湖以及灰湖与凤鸣湖轮虫种群间变异所占比例较低, 分别为3.78%和2.78%。粉煤灰污染水体与未污染水体萼花臂尾轮虫种群间保持较高水平的基因交流, 种群分化不明显。     

萼花臂尾轮虫种复合体遗传分化的空间格局

对采自中国东部八个地理区域中的萼花臂尾轮虫种复合体（Brachionus calyciflorus species complex）内124个轮虫克隆的核DNA ITS区进行了测序和分析,重建了萼花臂尾轮虫种复合体的系统发生树。研究发现73个单倍型聚合为三个支系,支系间序列差异百分比为4.2%－25.3%,表明萼花臂尾轮虫实际上是由三个隐种组成的种复合体,在广州、儋州和芜湖采样点均具有隐种共存现象。萼花臂尾轮虫种复合体的核苷酸多样性和单倍型多样性均较高,隐种III内各种群间遗传分化指数也较高,这可能是由于栖息地的片段化、有限的基因流以及在冰期瓶颈后拓殖种群的快速增长阻碍了有效基因流,加速了地理种群间的遗传分化。巢式支系分析显示部分巢支具有一定的系统地理格局,而Mantel检验表明种群间平均净遗传距离及遗传分化指数和地理距离间均没有显著的相关性。末次盛冰期之后的新仙女木事件（YD Event）可能对我国萼花臂尾轮虫隐种的分布和地理格局造成较大影响。在YD时期,三个萼花臂尾轮虫隐种可能退缩并共存于南岭以南地区的多个残遗种避难所,而此后的休眠卵长距离拓殖并伴随后期的栖息地片段化可能是形成当前地理格局的主要原因。萼花臂尾轮虫种复合体在全球范围内的地理分布可能与大陆板块构造运动有关。     

中国库蚊属四十个种(亚种)的分子系统发育关系研究(双翅目:蚊科)

【目的】对在中国有分布的库蚊属Culex种(亚种)的COⅠ序列和ITS2序列进行测序,构建和讨论这些种(亚种)的分子系统发育关系。【方法】测定了库蚊属20个种(亚种)的COⅠ和ITS2序列,并从NCBI数据库中下载了库蚊属另外20个种(亚种)的COⅠ和3个种(亚种)的ITS2序列。对库蚊属40个种(亚种)的COⅠ序列和其中23个种(亚种)的ITS2序列进行碱基构成、种间遗传距离和饱和度分析,并对COⅠ+ITS2序列进行ILD(incongruence length difference)检验。分别使用2种分子数据集(COⅠ和ITS2)的核苷酸序列,用最大似然法(ML)、贝叶斯法(BI)、邻接法(NJ)和最大简约法(MP)推断这些种的系统发育关系。通过Kishino-Hasegawa(KH)和ShimodairaHasegawa(SH)检验评估这4种系统树间的差异,确定最为合理的系统发育树。【结果】本研究新测序获得20种(亚种)的COⅠ和ITS2序列的长度范围分别为625~685 bp和300~559 bp。COⅠ和ITS2序列在库蚊属成对蚊种间的遗传距离分别是0.002~0.198和0.006~1.807。库蚊属23个种(亚种)的COⅠ+ITS2序列的ILD检验结果显示,数据集具有不相容性,因此COⅠ+ITS2序列不适用于这些种(亚种)的系统发育研究。经KH和SH检验显示,4种系统发育树中,基于COⅠ序列构建的BI树最为合理,而基于ITS2序列构建的MP树最为合理。基于COⅠ核苷酸序列所构建的BI树显示,除幼小库蚊Cx.infantulus和短须库蚊Cx.brevipalpis外,各亚属间成员聚类结果与传统的形态学归类结果吻合;路蚊亚属Lutiza和包蚊亚属Barraudius都归入库蚊亚属Culex内;梅蚊亚属Maillotia和新库蚊亚属Nexoculex聚为一支;库状蚊亚属Culiciomyia、真黑蚊亚属Eumelanomyia和簇角蚊亚属Lophoceramyia均显示为单系。基于ITS2序列所构建的MP树显示,各亚属间和种(亚种)间关系混乱。【结论】重建的分子系统发育树表明库蚊亚属不是一个单系群。在重建库蚊属系统发育关系时,相较于ITS2和COⅠ+ITS2,COⅠ是更为理想的分子标记。本研究构建的分子系统发育关系为中国库蚊属中各亚属和各种(亚种)之间的亲缘关系的研究奠定了基础。