番石榴实蝇性别决定基因 Bcotra 和 Bcotra-2 的克隆、序列特征及表达分析

【目的】对番石榴实蝇 Bactrocera correcta (Bezzi)性别决定基因 transformer 和 transformer 2 的cDNA和基因组DNA序列进行克隆和分析,明确这2个基因的结构特征及其在不同发育阶段和雌、雄成虫不同组织中的表达模式,为进一步的功能研究和番石榴实蝇遗传性别品系(genetic sexing strain, GSS)的建立奠定基础。【方法】利用PCR结合RACE技术克隆番石榴实蝇2个性别决定基因的cDNA全长和内含子序列,利用不同的生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用半定量RT-PCR检测这2个基因在番石榴实蝇的不同发育阶段及雌、雄成虫不同组织(精巢、卵巢、中肠和脂肪体)中的表达分布。【结果】克隆得到番石榴实蝇 transformer 和 transformer 2 的cDNA全长序列,分别命名为 Bcotra 和 Bcotra-2 。 Bcotra 存在性别特异剪接,雌虫 Bcotra 的cDNA全长1 673 bp,其开放读码框(ORF)为1 242 bp,编码413个氨基酸(GenBank登录号为KP712876);雄虫Bcotra cDNA全长2 025 bp,比雌虫多2个外显子,但由于外显子上有多个终止密码子,因此,不能编码完整的有功能的Tra蛋白(GenBank登录号为KP712877)。 Bcotra-2 不存在性别特异剪接,cDNA全长1 458 bp,其开放读码框(ORF)为756 bp,编码251个氨基酸,具有RNA结合蛋白的典型特征(GenBank登录号为KM658207)。Bcotra-2有8个外显子,7个内含子。氨基酸序列比对和系统进化关系表明,两个基因的系统发育关系一致,Tra-2与目前已报道的双翅目Tra-2具有很高的同源性,而Tra的保守性较Tra-2要低。半定量RT-PCR结果显示, Bcotra 和 Bcotra-2 在番石榴实蝇的不同发育阶段及雌、雄成虫不同组织中都有表达。【结论】本研究明确了Bcotra 和 Bcotra-2 的基因组DNA和cDNA结构特征,Bcotra 和 Bcotra-2 在番石榴实蝇的不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达,序列分析发现这两个性别决定基因均具有Tra/Tra-2结合位点、内含子剪接抑制序列位点,其中 Bcotra 具有RNA结合蛋白的结合位点,暗示了这2个基因可能通过翻译后相互作用调控雌、雄体性发育。Bcotra 存在性别特异剪接,雌虫特有的一段963 bp的内含子序列可以用于番石榴实蝇遗传定性品系的载体构建。     

桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。     

桔小实蝇细胞凋亡基因hid的克隆及不同发育阶段表达分析

【目的】细胞凋亡是一个细胞自动结束生命的过程,也称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）。头部退化缺陷基因 (head involution defective, hid )是昆虫细胞凋亡基因RHG家族的成员,该家族基因通过克服凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins, IAPs）的保护作用来保证PCD的发生。本研究旨在克隆和分析桔小实蝇Bactrocera dorsalis的hid基因,并研究其在各发育阶段的表达情况。【方法】利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇hid基因的cDNA全长序列。利用荧光定量PCR对hid基因在桔小实蝇不同发育阶段的转录水平进行分析。【结果】克隆获得桔小实蝇hid cDNA序列,将其命名为Bdhid (GenBank登录号为KJ461670),其开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸。氨基酸序列分析显示其具有一个短的N-端肽基元( IAP-binding-motif, IBM) 和C-端Grim Helix 3 (GH3) 结构域,与其他已知的双翅目昆虫hid基因有较高的同源性。实时荧光定量PCR检测结果表明,该基因在桔小实蝇的幼虫期表达水平较低,蛹期及成虫期表达量显著升高。【结论】这些结果为进一步研究hid基因在桔小实蝇细胞凋亡途径中的功能及其转基因条件致死品系的获得奠定了基础。     

苹果蠹蛾气味结合蛋白基因CpomOBP20的克隆及表达分析

[目的] 通过克隆苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因cDNA序列,分析其序列特征和表达谱,旨在更好地了解OBP基因在苹果蠹蛾生命活动过程中的作用,为该害虫的绿色防控提供理论支撑。[方法] 采用RT-PCR法扩增苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因cDNA序列,并使用生物信息学软件对其核苷酸和氨基酸序列进行分析;基于qPCR技术分析CpomOBP20基因在苹果蠹蛾4龄幼虫不同组织(头、血淋巴、表皮、脂肪体、中肠、马氏管和唾液腺)以及雌雄成虫不同末端组织(头、触角、下唇须、喙、足和翅)中的表达情况,利用分子对接研究了CpomOBP20与3种保幼激素的结合能力。[结果] 苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因的开放阅读框长459 bp,共编码152个氨基酸,等电点为6.30,蛋白分子质量为16.264 ku,N末端具有20个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白质序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,属于Classical OBP。序列分析表明,CpomOBP20的氨基酸序列与小菜蛾OBP (XP_011557123.1)的一致性最高,在亲缘关系上更加接近。qPCR结果表明,CpomOBP20基因在苹果蠹蛾4龄幼虫以及雌雄成虫不同组织中均有表达,其中在4龄幼虫的血淋巴中表达量最高,在雌雄成虫表达量最高的分别是翅和足,其次是头部。分子对接结果表明,CpomOBP20与3种保幼激素均具有较好的结合能力,可能参与保幼激素的结合与转运。[结论] 本研究明确了CpomOBP20的核苷酸和氨基酸序列的组成及编码蛋白的理化性质,并推测CpomOBP20的作用可能不仅局限于嗅觉识别,在非嗅觉器官中也可能起着重要的生理作用,为今后更深入地探究气味结合蛋白在苹果蠹蛾生命活动中的作用机理提供数据支撑。     

昆虫遗传转化品系的常用标记

遗传转化标记是将遗传修饰昆虫从野生型种群中分辨出来的根据,遗传转化昆虫的鉴定、转化品系的维持及其遗传稳定性的监测都依赖于可靠的标记系统,发展易于应用和监测的转化标记能够极大地促进害虫遗传防治的相关研究。用于遗传修饰昆虫的转化标记主要有昆虫眼睛颜色标记基因、抗药性标记基因和荧光蛋白标记基因等。非果蝇类昆虫首个遗传转化品系的鉴定是通过眼睛颜色突变而实现,但大多数昆虫物种没有可用的突变体或缺少相应基因的信息,从而限制了眼睛颜色标记的应用。抗药性基因标记虽然能够通过对转化昆虫进行集体选择而大幅度提高筛选转化体的效率,但由于其鉴定的准确性不高且存在安全性问题,未得到广泛应用。荧光蛋白标记基因的发展则显著拓宽了能够转化的昆虫种类。从水母分离的绿色荧光蛋白(GFP)经突变方法获得了多种不同荧光性质的突变体,经人为修饰后与适宜的强启动子构成转化标记载体,能够有效鉴定更多昆虫物种的遗传转化个体,其中应用较多的是增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。此外,从珊瑚属海葵中分离得到的红色DsRed标记基因提供了多样化的红色荧光蛋白选择,在某些生物中DsRed与GFP联合应用的表现明显优于GFP突变体,所以其应用前景也非常广泛。本文着重从眼睛颜色、抗药性和荧光蛋白等3个方面阐述了标记基因的发展历史与现状,并对其今后的发展方向进行了展望。     

盐析法提取烟粉虱基因组DNA

所提供的提取烟粉虱基因组DNA的新方法-盐析法,同氯仿-异戊醇抽提法相比,无需利用研磨棒,提取基因组DNA所用时间更短并且有效地避免了氯仿-异戊醇对实验人员的身体伤害.经检测,利用盐析法可以有效的提取B型烟粉虱的卵、伪蛹和成虫、Q型、ZHJ-1型与ZHJ-2型烟粉虱成虫的基因组DNA,并且适用于RAPD、COI、SSR分子标记的PCR扩增.     

中国传统淀粉类食品——粉丝的研究进展

当前我国许多优质的传统淀粉食品不被大家关注,甚至存在许多消费误区。本文主要介绍了充分利用淀粉老化性质的中国传统淀粉食品——粉丝的研究进展,为中国传统淀粉类食品品质评价体系的建立与完善奠定了一定的基础,旨在让更多的消费者正确认知、认识、认可中国传统淀粉类食品。     

遗传控制技术在实蝇类害虫中的研究进展

实蝇类害虫严重危害多种水果和蔬菜,是世界果蔬产业最重要的害虫类群之一,严重影响了发生地的果蔬生产和出口贸易活动。昆虫不育技术(SIT)是一种物种特异和环境友好型防治措施,在多种实蝇类害虫的防治、阻截和根除中起到了不可替代的重要作用。通过分子生物学技术对昆虫的基因组进行遗传修饰,可对SIT进行改进,提高其防控效果并扩大应用的物种范围,近年来相关方面的研究已取得重要进展,成为害虫遗传控制的研究热点。本文阐述了通过受四环素调控的tet-off基因表达系统来实现昆虫"不育"的基本原理和在果蝇及其他几种主要实蝇类害虫中建立的不同类型的遗传控制体系,以及类似体系在其他农业昆虫中的应用情况。简要介绍了在橘小实蝇遗传控制技术体系构建方面的工作进展,并对该技术的在害虫综合治理(IPM)尤其是实蝇类害虫防治中的应用前景进行了讨论和展望。     

淀粉凝胶食品——粉皮、凉粉的研究进展

介绍了充分利用淀粉老化性质的淀粉凝胶食品——粉皮、凉粉的研究进展,旨在让更多的消费者正确地认识、认知、认可淀粉凝胶食品。     

昆虫普通气味结合蛋白研究进展

昆虫气味结合蛋白(OBPs)参与昆虫识别环境中气味信息的第一步反应,在调控昆虫生命活动中起着重要的作用。普通气味结合蛋白(GOBPs)主要参与昆虫对寄主植物挥发物或信息素的识别。本文总结了GOBPs基因的分子特征和生理功能,以及GOBPs基因在不同组织、性别和发育阶段的表达特性;针对GOBPs与性信息素结合蛋白(PBPs)在染色体上串联形成的GOBPs/PBPs亚家族基因簇,阐述了GOBPs基因的进化起源、扩增与丢失现象;梳理了昆虫GOBPs基因在虫情监测和害虫防治等方面的应用前景,提出GOBPs基因是未来害虫生物防治的重要靶点。