伪狂犬病毒立即早期基因5'端特异性反义RNA对病毒增殖的影响

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,基因组为线状双链DNA,长约150kb,至少可编码70～100种蛋白质.根据伪狂犬病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因(Immediateearly gene),早期基因(Early gene)和晚期基因(Late gene),这三类基因依此以级联方式调节[1].第一个被转录的基因是立即早期基因,它的转录即使在细胞蛋白质合成被放线菌酮(Cycloheximide)抑制的情况下也能进行.     

猪伪狂犬病毒鲁A株TK基因的序列测定及其结构功能与进化分析

对猪伪狂犬病毒鲁A株(PRV LA株)TK基因进行了克隆和序列测定,并分析比较了该序列与PRV NIA-3株、Ea株、SH以及HSV-1和VZV的同源性,结果表明:在全长1048bp的DNA序列中,包括着一个963bp的开放阅读框(ORF),可编码320个氯基酸组成的多肽;在整个TK基因的ORF内,PRV LA株与PRV NIA-3株、PRV Ea株、PRV SH株、HSV-1、VZV的TK基因比较,核苷酸的同源性分别为98.9%、99.5%、99.3%、36.4%、39.1%,氨基酸的同源性分别为98.4%、99.7%、98.7%、36.6%、37.2%.PRV LA株TK具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列.将PRV-LA TK、人类和小鼠的胸苷酸激酶、人类脱氧胞苷激酶、人类腺苷酸激酶的对应于这两个亚结构域的氨基酸用DNA Star分析的进化树表明,疱疹病毒的TK与人类和小鼠的胸苷酸激酶的亲缘关系比与人类脱氧胞嘧啶激酶的亲缘关系更近,因此疱疹病毒的TK基因在进化上可能起源于宿主细胞的胸苷酸激酶基因.     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。     

C3d-M28增强伪狂犬病毒gC基因体液免疫

研究补体C3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gC基因DNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gC基因串联后,克隆到载体pcDNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgC-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgC-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gC蛋白的重组质粒(sgC)免疫组产生的ELISA抗体高17倍,对致死剂量(316LD50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gC基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平,显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。     

低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证低pH孵放法对不同厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG的pH值为3.8～4.4,在23～25℃环境中,孵放21天可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥5.50～6.62和≥5.38～6.62logTCID50/0.1ml。因此,低pH孵放法是一种安全、有效且简便实用的灭活脂包膜病毒的方法。     

辛酸盐灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证一定浓度的辛酸盐对某一厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG在辛酸钠(0.7±0.2mmol/g蛋白)、pH(5.1±0.1)、29.5~30.5℃,孵放90min可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥4.00~4.12和≥5.25~5.75log TCID50/0.1ml。因此,辛酸盐是一种安全、有效、快速的灭活脂包膜病毒的灭活剂。     

伪狂犬病毒跨突触示踪视觉系统神经网络的研究进展

伪狂犬病毒（PRV）作为一种亲神经性的病毒,它以其自我复制、跨突触、特异性传递的三大优势在揭示神经系统中功能性神经元之间的连接发挥着重大的作用。经基因重组后的伪狂犬病毒不但继承了原有病毒的优势,同时还延伸出其他特异性的功能,如重组后加入了荧光蛋白的伪狂犬病毒在视觉系统神经通路的研究中发挥了重要作用。本文就目前伪狂犬病毒跨突触示踪视觉系统神经网络中的研究做一综述。     

疱疹病毒的微生态问题

疱疹病毒的分子生物学基础疱疹病毒科在医学领域中熟知已久,可分为三个亚科,α、β和γ。α亚科包括人和动物的疱疹病毒,如人的单纯疱疹病毒1型、2型(HSV—1,2),牛乳腺炎病毒,假狂犬病毒,马流产病毒等,其 DNA 分子量范围为87～105×10~6d。β亚科包括人和鼠的巨细胞病毒(HCMV,MCMV),其DNA 分子量为130～150×10~6d.γ亚科包括人的Epstein-Barr 病毒(EBV)和几种灵长类(猴)病毒,其 DNA 分子量为85～115×10~6d。最近发现的人 B 细胞白血病病毒(HBLV),称为人疱疹病毒—6型(HHV—6),亚科不明。     

猪圆环病毒2型－细小病毒－伪狂犬重组病毒免疫小鼠试验研究

为了研究表达猪2型圆环病毒ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒疫苗株SA215(D)的疫苗价值,对该病毒株安全性、免疫原性、保护力及对PRV Fa株定值进行了研究。研究结果表明重组病毒SA215（D）毒力显著低于PRV Fa强毒株,可以抵御伪狂犬病强毒Fa株的攻击,并能抵御其在小鼠体内的定植;抗体检测显示SA215（D）免疫小鼠后第2周抗PRV、PCV2和PPV的抗体水平均很低,加强免疫后第4周抗体水平大幅上升,且显著高于阴性对照组,而与阳性对照组无明显差异,表明SA215（D）可诱导小鼠产生体液免疫反应。淋巴细胞增殖试验显示SA215（D）可诱导小鼠产生较强的淋巴细胞增殖反应,与亲本株SA215组相比,差异显著(0.01     

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证S/D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38~5.88和≥3.50~4.75logTCID50/0.1ml,表明S/D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。     

人疱疹病毒6型基因编码蛋白研究进展

人疱疹病毒6 型( HHV-6) 是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA 病毒, 属疱疹病毒β亚科。研究推测HHV-6 基因组可编码80 ～100 种蛋白质, 包括膜蛋白、即刻早期( IE) 蛋白、DNA 蛋白、DNA 包装蛋白、病毒装配蛋白等。本文就HHV-6 基因编码蛋白的特性和功能研究进展予以综述。     

猪圆环病毒2型的PCR检测方法应用

本研究登录Genbank对猪圆环病毒2型基因的序列进行分析,用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物,试图选择一种比较合理的PCR方法检查PCV2感染的病原,以期这种PCR方法可以有效分析猪综合征障碍病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒的扩增(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等比较常见的病原。研究结果表明,在PCV2进行扩增阳性样品检测中,发现一条异常447 bp的DNA条带,对产物测序结果进行扩增分析,证明其是PCV ORF2基因序列。敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度时达到了9.8×10^-4ng/μL。PCR实验具有良好的稳定性和重复性。根据对66例临床病猪的分析表明,在PCV2的检测中阳性感染率是27.26%,这可能受到HCV、PRRSV、PRV、PPV等多种病毒的感染,其中混合感染的比例达到了72.23%。     

伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达

利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株(PRV HB)糖蛋白G(gG)基因,进行了序列测定和分析.结果显示扩增和测序片段长1804bp,G+C含量68.78%.gG基因ORF长1500bp,编码500个氨基酸组成的多肽.与PRV Rice 株gG基因比较,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为98%、84.1%.320～380位之间的氨基酸序列存在较大差异.根据序列分析结果,选取gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体pET28a(+)进行表达.经SDS-PAGE和Dot-ELISA分析证实,表达出分子量大小分别约为55kD和63kD的特异性gG多肽,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制gG-ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

伪狂犬病毒gI基因的克隆表达及其对病毒增殖的影响

从伪狂犬病毒(PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因,序列分析结果表明,gI基因编码区全长1101bp,可编码366个氨基酸残基,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现,Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变,致使gI基因的读码框架后移,从而导致Ea株gI较rice株长16个氨基酸残基。将gI基因克隆到真核表达载体pcDNA31+中的人巨细胞病毒早期启动子下游,构建的真核表达质粒转染PK15细胞,间接免疫荧光检测证实gI获得正确表达。进一步测定天然缺失gI的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位(pfu)和组织细胞培养半数感染量(TCID50),结果显示：Bartha株在表达gI细胞系中的pfu和TCID\-\{50\}分别为对照细胞系的164%和200%。说明gI具有促进病毒增殖的功能。     

应用一步PCR法检测并鉴定马疱疹病毒1型和4型

聚合酶链反应（PCR）可作为一种快速检测并鉴别马疱疹病毒1型（EHV－1）和马疱疹病毒4型（EHV－4）的诊断方法。PCR引物是根据编码EHV－1和EHV－4的糖蛋白B（ gB)基因上的共有的核苷酸序列或型特有的核苷酸序列设计的。利用这两种病毒的型特异性混合引物,在一步PCR反应中检测并鉴别EHV－1和EHV－4,而同一疱疹病毒科的单纯疱疹病毒1型（HSV－1）、伪狂犬病毒（PRV）、马立克氏病病毒（MDV）均无特异性扩增。应用建立的PCR方法检测了普氏野马流产胎儿病科,实验结果表明,这种PCR方法是一种直接检测并鉴定EHV－1和EHV－4的快速、敏感的诊断方法,同时,它可在一步PCR反应中直接鉴别这两种病毒,可用于病料中EHV－1和EHV－4检测的初步筛选。     

冻干加热处理凝血因子类制剂的病毒灭活验证

在病毒灭活验证过程中,比较了冻干后不同加热方法对凝血因子类制剂中伪狂犬病毒(PRV)的灭活效果,包括80℃干烤72h、100℃水浴加热30min以及100℃蒸汽加热30min方法。结果表明80℃干烤72h对制品中PRV灭活较彻底,另外两种方法对制品中PRV的灭活效果均不理想。     

2018−2019年四川省伪狂犬病毒的流行病学调查及gC、gE、TK基因遗传进化分析

【背景】伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是养猪生产中的一类重要病原,自2011年以来,我国接种了Bartha-K61疫苗的养殖场暴发了大规模的伪狂犬病疫情。【目的】调查目前四川省PRV的流行病学以及毒株的遗传进化,对2018?2019年从86个猪场收集的384份疑似PRV感染样本进行病原学检测。【方法】根据PRV-gE基因检测引物对采集的384份样品进行PCR扩增,并对不同季节、不同地区的PRV阳性率进行统计,将PRV感染与临床症状的相关性进行统计学分析。选择部分PRV阳性样本在BHK-21细胞上进行病毒的分离,随后进行分离毒株的gC、gE、TK基因的遗传进化分析。【结果】PRV阳性猪只的比率为9.9% (38/384);阳性猪场比率为16.3% (14/86);流产母猪的PRV阳性率为32.1% (27/84);种公猪阳性率为2.0% (4/198);神经症状猪的PRV阳性率为11.4% (4/35);呼吸症状猪的PRV阳性率为4.5% (3/67)。统计学分析表明,PRV感染与母猪和公猪繁殖障碍症状相关(P<0.01)。其中,冬季(12月、1月、2月) PRV阳性率最高,约为33.0% (31/94);春季(3月、4月、5月)的阳性率为9.1% (3/33);夏季和秋季的阳性率分别约为1.5% (2/130)和1.6% (2/127)。在2018?2019年共分离出3株PRV毒株,分别命名为PRV-SN、PRV-DJY、PRV-CD。PRV-XJ为本实验室2016年在四川省分离的一株毒株,为了了解毒株的遗传进化信息,先后扩增了这4个毒株的gC、gE、TK基因。序列比对表明四川分离株与国内株相似,存在额外的零星性突变和缺失。【结论】养殖场仍应加强对种猪群中伪狂犬病的净化。     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。