冻干加热处理凝血因子类制剂的病毒灭活验证

在病毒灭活验证过程中,比较了冻干后不同加热方法对凝血因子类制剂中伪狂犬病毒(PRV)的灭活效果,包括80℃干烤72h、100℃水浴加热30min以及100℃蒸汽加热30min方法。结果表明80℃干烤72h对制品中PRV灭活较彻底,另外两种方法对制品中PRV的灭活效果均不理想。     

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证S/D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38~5.88和≥3.50~4.75logTCID50/0.1ml,表明S/D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。     

流感减毒活疫苗效力试验检测新方法的建立

目的建立基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法,并进行初步应用。方法对病毒接种方式、流感病毒感染MDCK细胞培养时间、一抗和酶标二抗的稀释度、封闭液等ELISA反应条件进行筛选优化。采用建立的方法检测3批流感减毒活疫苗原液和1批疫苗成品,并与鸡胚培养法检测结果进行比较。结果选择直接接种法作为接种方式,病毒感染细胞后培养48 h进行NP蛋白表达的检测; ELISA检测条件一抗稀释度为1∶4 000,酶标二抗稀释度为1∶4 000,2%牛血清白蛋白封闭2 h,检测结果 P/N值最大。用建立的方法检测流感减毒活疫苗原液及疫苗成品效力,与鸡胚培养法检测结果差异无统计学意义(P0.05),具有较好的一致性。结论建立了基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗效力试验方法,可用于生产过程中流感减毒活疫苗原液和成品的检定。     

人巨细胞病毒IgM抗体国家参考品的研制

目的为了对人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)IgM抗体检测试剂进行统一评价,研制HCMVIgM抗体国家参考品,用于控制试剂盒的质量。方法收集正常人与感染者的标本,采用多实验室联合标定的方法确认参考品的试验结果,并经一系列的破坏条件进行稳定性和均匀性考核。结果考核的敏感性和准确性符合国家参考品的要求。结论该参考品能用于临床检测试剂的质量控制。     

以重组人巨细胞病毒pp65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法

人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染是造成器官移植失败的重要原因。建立灵敏、特异的检测方法可为及早发现感染、及时给予抗病毒治疗提供依据。以离子交换和分子筛方法纯化重组表达的HCMVpp65(rp65hp)抗原,经两步纯化后,rp65hp纯度达到95%。免疫家兔制备的抗血清,ELISA抗体滴度高达1∶2560000;免疫印迹证明能与HCMVpp65抗原特异反应。将HCMV病毒感染细胞,以纯化的多克隆抗体建立了间接免疫荧光法,成功地检测到细胞中的病毒。因此,该方法为临床检测HCMV病毒活动性感染奠定了良好的基础。     

辛酸盐灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证一定浓度的辛酸盐对某一厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG在辛酸钠(0.7±0.2mmol/g蛋白)、pH(5.1±0.1)、29.5~30.5℃,孵放90min可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥4.00~4.12和≥5.25~5.75log TCID50/0.1ml。因此,辛酸盐是一种安全、有效、快速的灭活脂包膜病毒的灭活剂。     

板层人工角膜辐照法病毒灭活验证方法的建立及灭活效果验证

目的建立板层人工角膜钴-60照射病毒灭活验证方法,用该方法对脂包膜病毒灭活效果进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)为指示病毒,将干燥的板层人工角膜浸泡在高滴度病毒液中,在2~8℃浸泡5 h,经剪碎、研磨等步骤后4℃放置12 h,确立角膜吸附和释放病毒的条件。之后,将吸附病毒并呈干燥状态的角膜以0、5、10、15、20、25 k Gy辐照剂量进行钴-60辐照,以确立的条件释放病毒并进行滴定,考察灭活效果。结果板层角膜在2~8℃浸泡5 h可吸附足量病毒;病毒滴度可达到4 lg值以上,满足病毒灭活验证的要求。样品经25 k Gy剂量钴-60照射后灭活PRV为2.75~3.25 lg TCID50/100μL,灭活后的样品在敏感细胞上盲传3代均未出现细胞病变。结论成功建立了板层人工角膜病毒灭活验证的方法,并验证采用钴-60辐照法对PRV有较好的灭活效果。     

应用复合增强剂扩增人巨细胞病毒pp65全基因

在PCR过程中 ,模板GC含量过高是一个不利因素。如果设计扩增片段较长 ,则进一步增加了PCR扩增的难度。解决这一问题对于以PCR成功获取富含GC的长基因有非常重要的意义。以人巨细胞病毒pp65全基因 (约 1 95 0bp ,GC %为 67%)为例 ,在PCR系统中测试不同添加剂(甘油、乙醇、DMSO、甜菜碱等 )及各种组合 ,摸索扩增目的基因的最佳条件。结果发现 :无或单一的添加剂都不能获得目的基因片段 ,只有当同时使用DMSO和甜菜碱 ,并在适当浓度时才能够获得特异产物。在PCR系统中包含复合增强剂能有助于高GC %、长基因片段的扩增 ,为解决此类问题提供了一种有效的途径。     

低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证低pH孵放法对不同厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG的pH值为3.8～4.4,在23～25℃环境中,孵放21天可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥5.50～6.62和≥5.38～6.62logTCID50/0.1ml。因此,低pH孵放法是一种安全、有效且简便实用的灭活脂包膜病毒的方法。     

中国婴儿中脊灰母传抗体水平对两种疫苗免疫效果的影响

为了了解2月龄婴儿中针对脊髓灰质炎病毒的中和抗体水平,并探讨母传抗体对脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)免疫效果的影响。对416名2月龄婴儿分别接种OPV和IPV,采集免疫前后血清,用微量中和法检测血清中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,评价抗体GMT水平及4倍增长情况。检测结果显示,2月龄婴儿母传抗体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型阳性率分别为45%、38.2%和17.5%,抗体GMT水平为9.0、8.1和5.2。经接种两组疫苗后,母传抗体阳性者与阴性者免后抗体GMT水平相比,OPV组无明显差异,IPV组阳性者略低于阴性者。在免前抗体滴度<1∶32人群中,OPV组免后抗体滴度4倍增长率及几何滴度增长倍数分别为:Ⅰ型93.6%、71.2;Ⅱ型98.2%、43.7;Ⅲ型91.7%、47.9;IPV组免后抗体滴度4倍增长率及几何滴度增长倍数分别为:Ⅰ型82%、9.4;Ⅱ型62.8%、5.1;Ⅲ型95.6%、11.7;在免前抗体滴度1∶32～1∶128人群中,OPV组Ⅰ型92.3%、23;Ⅱ型86.4%、13.9;Ⅲ型55.6%、4.1;IPV组Ⅰ型48%、2.5;Ⅱ型15%、0.9;Ⅲ型55.6%、2.7。目前中国2月龄婴儿免前脊灰抗体阳性率较高,尤其是Ⅰ、Ⅱ型。脊灰母传抗体对两种疫苗免疫效果有一定干扰,对IPV疫苗的影响较为明显。