猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSV ORF7、PPV VP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法.应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52.3%;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26.9%.另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7.5%.由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍.     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断。根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORF1a基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段。试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6TCID50/mL LP-PRRSV和18TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应;对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致。环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别。     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSVORF7、PPVVP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法。应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和,或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52．3％;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26．9％。另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7．5％。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。     

多重PCR检测PRV、PPV、PCV方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)的gE、gI基因序列、猪细小病毒(PPV)的E蛋白的基因序列、II型猪圆环病毒(PCV-2)的ORF2基因序列,分别设计并合成3对能特异性扩增PRV、PPV、PCV-2的引物,通过DNAstar软件分析这3对引物不存在cross d im er。建立了PCR方法分别检测PRV、PPV、PCV-2,然后通过条件的优化,建立了PCR同时检测PRV、PPV、PCV-2的方法并研制出试剂盒。对试剂盒的特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性,有效期在-20℃至少可以保存1年。     

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测

目的:对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法:非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果:受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的O型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论:猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪圆环病毒II型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

摘要:【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小 鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

Detection of porcine parvovirus using a taqman-based real-time pcr with primers and probe designed for the NS1 gene

A TaqMan-based real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was devised for the detection of porcine parvovirus (PPV). Two primers and a TaqMan probe for the non-structural protein NS1 gene were designed. The detection limit was 1 x 102 DNA copies/μL, and the assay was linear in the range of 1 x 102 to 1 x 10? copies/μL. There was no cross-reaction with porcine circovirus 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), classical swine fever virus (CSFV), or Japanese encephalitis virus (JEV). The assay was specific and reproducible. In 41 clinical samples, PPV was detected in 32 samples with the real-time PCR assay and in only 11 samples with a conventional PCR assay. The real-time assay using the TaqMan-system can therefore be practically used for studying the epidemiology and management of PPV.     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测简

目的：对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法：非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果：受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的0型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论：猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。     

Construction and immunogenicity of recombinant pseudorabies virus expressing the modified GP5m protein of porcine reproduction and respiratory syndrome virus

Pseudorabies virus (PRV),an alpha-herpesvirus,has been developed as a live viral vector for animal vaccines.However,the PRV recombinant virus TK-/gE-/GP5+expressing GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),based on the PRV genetically depleted vaccine strain TK-/gE-/LacZ+,scarcely stimulated the vaccinated animals to produce neutralizing antibodies against PRRSV.To develop a booster-specific immune response of such PRV recombinants,the ORF5m gene (the modified ORF5 gene having better immune responses)was substituted for the ORF5 gene and introduced into PRV TK-/gE-/LacZ+,resulting in a PRV recombinant named TK-/gE-/GPSm+,which expressed the modified GPSm protein.The recombinant virus was confirmed using PCR,Southern blotting and Western blotting.TK-/gE-/GPSm+and TK-/gE-/GP5+expressing the authentic GP5 protein were inoculated into Balb/c mice to evaluate their immune responses.The results indicated that the protecting neutralization antibodies (the 3/6 vaccinated mice obtained 1:16)and cell immune responses induced by TK-/gE-/GPSm+against PRRSV were higher than that induced by TK-/gE-/GP5+.Thus,the development of the new PRV recombinant expressing the modified GP5m protein as a candidate vaccine established the basis for the study of bivalent genetic engineering vaccines against PRRSV and PRV.     

Prevalence of antibodies to selected viral pathogens in wild boars (Sus scrofa) in Croatia in 2005-06 and 2009-10

We determined prevalence of antibody to selected viral pathogens important for domestic pigs and livestock in 556 wild boar (Sus scrofa) sera collected during 2005-06 and 2009-10 in four counties in Croatia. These counties account for an important part of the Croatian commercial pig production and have a high density of wild boars. Samples were tested for antibodies to porcine parvovirus (PPV), Aujeszky's disease virus (ADV), porcine circovirus type 2 (PCV2), swine influenza virus, porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV), porcine respiratory coronavirus (PRCV), transmissible gastroenteritis virus, and swine vesicular disease virus (SVDV). Antibodies to all of the infectious pathogens except SVDV were detected. There was a statistically significant difference in prevalence between the two periods for PPV, ADV, PCV2, PRRSV, and PRCV, with a higher prevalence of PPV and ADV in the 2009-10 period (P<0.05). During the same period, the prevalence of PCV2, PRRSV, and PRCV was lower (P<0.05). Our results provide information on the current disease exposure and health status of wild boars in Croatia and suggest that wild boars may act as a reservoir for several pathogens and a source of infection for domestic pigs and other livestock as well as humans, especially for ADV.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3基因的重组伪狂犬病病毒的构建

猪繁殖与呼吸综合征 (porcinereproductiveandrespiratorysyndrome ,PRRS)是引起怀孕母猪早产、流产、死胎及仔猪呼吸系统疾病的一种新发现的病毒性传染病[1] .该病毒的基因组为单股正链RNA ,约15kb ,含有 8个开放阅读框架 (ORFs) ,ORF1编码病毒非结构蛋白 (依赖RNA的RNA聚合酶 ) ,ORF2 ORF7编码病毒的结构蛋白 .其中ORF3含有 2 6 5个氨基酸 ,编码的GP3蛋白为高度糖基化的结构蛋白 ,有 7个糖基化位点 ,具有免疫原性[2 ,3 ] .目前 ,用于预防PRRS的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗 ,虽然都有一定的免疫效果 ,但由于PRRS抗体依赖性…     

PCR检测伪狂犬病病毒DNA

 根据伪狂犬病病毒 (PRV)gB基因的序列 ,设计并合成了一对引物 ,以闽A株细胞培养毒为模板 ,筛选最佳反应条件 ,建立了检测PRV的PCR方法 应用该方法对Fb、Bartha、BJ、GD、V2F4、S、S3、SR、Buk、Shope、Norden、MinkⅢ、HB、F8、F9、F12等毒株的细胞培养液进行基因扩增 ,均获得了分子量为 2 81bp的特异性目的DNA片段 ,而对Vero细胞与FMDV、SVDV、HCV、PRRSV、JEV、PPV等病毒进行检测 ,结果均为阴性 ,没有出现交叉反应 对PRV毒株扩增的产物测序 ,结果序列与文献报道一致 ,证明PCR扩增产物和方法的特异性 对 1994～ 2 0 0 0年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种 ,用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等 3种方法进行检测 ,结果前 2种方法检测为阳性的 ,PCR检测均为阳性 ;PCR检测为阴性 ,前 2种方法检测也为阴性 ;可是 ,前 2种方法检测为阴性的 ,PCR却检测出部分阳性 ;经x2 检验 ,证明PCR检出率明显高于前 2种方法的检出率 对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测 ,其最低检出量为 15 8pg 对 1999～ 2 0 0 0年期间广东、福建、海南等省的 31个大中型猪场送检的 191份病料进行检测 .结果病料阳性率为 2 6 2 % ( 50 191) ,猪场阳性率为 71% ( 2 2 31) 实验结果表明 ,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断