犬卵透明带3蛋白原核表达和抗血清的制备

在研发控制流浪犬卵透明带3(CZP3)免疫不育疫苗的过程中,需要制备特异性的CZP3抗血清进行免疫检测。本研究克隆获得CZP3的c DNA(全长1 281 bp)和除去跨膜区和信号肽的核心片段(CZP3C,984 bp),通过构建原核表达载体p ET28a-CZP3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)。在28℃下以0.6 mmol·L~(-1)异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导表达4 h,获得CZP3C融合蛋白。利用CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备特异性的抗血清,并对抗血清的特异性和效价进行评价。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白以包涵体形式存在。经过镍柱亲和纯化及8 mmol·L~(-1)尿素复性后,获得了高纯度的CZP3C融合蛋白。用0.8μg·μL~(-1)的CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,免疫后的兔抗血清用Western blot及间接免疫荧光实验检测,结果证明CZP3C兔抗血清具有较高的特异性,ELISA检测效价为1∶409600。本研究所制备的抗血清能够为流浪犬免疫不育疫苗的研制提供检测材料。     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMAL-c2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMAL-c2-PVY0CP.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明,这一表达栽体在E.coli DH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白.以amylose resin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1:1024的特异性抗血清.用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Western blotting对PVY进行检测.     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

Ezrin多克隆抗体制作及应用

构建Ezrin原核重组表达载体pET-28a(+)-ezrin,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导获得Ezrin蛋白,将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠(KM),获得抗血清,采用ELISA和Western blotting,免疫荧光测定其效价和特异性。ELISA对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应;通过Western blotting对抗血清进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带,其相对分子量为82 kD,与预测分子量相符;免疫荧光试验表明抗血清可以识别细胞内的Ezrin蛋白,且定位情况与文献报道相符。最后通过protein G对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的Ezrin多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。     

黄鳝IgM的分离纯化及兔抗黄鳝IgM抗血清的制备

目的 分离纯化黄鳝血清免疫球蛋白,制备其兔抗血清,并检测抗血清的特异性。方法 用Protein A亲和层析的方法纯化黄鳝血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价,通过western blotting检测抗血清的特异性。结果 纯化了黄鳝血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗黄鳝免疫球蛋白血清效价为1∶32,western blotting结果显示抗血清具有很好的特异性。结论 成功纯化了黄鳝免疫球蛋白,制备了兔抗黄鳝IgM抗血清,为建立黄鳝的血清学检测系统奠定了基础。     

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的表达、纯化和复性研究

报道重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAOase)的研究进展。重组NAOase由大肠杆菌argE基因编码,在重组菌BL21(DE3)-pET22b-argE中的表达量为32.5%,大多以无活性的包涵体存在。低温诱导可增大有活性的可溶表达部分的比例。可溶性NAOase经Ni-NTA凝胶亲和纯化后得到SDS-PAGE电泳纯的酶,比酶活为1193.2u/mg蛋白。诱导条件影响整菌蛋白的成分及比例。37℃诱导生成的包涵体经尿素梯度洗涤后纯度较22℃高。低的蛋白浓度和合适的氧化还原体系是影响复性的关键因素。稀释法和透析法皆可使包涵体部分复性。在合适的条件下以稀释法复性时,约有17.78%包涵体可顺利复活。包涵体经尿素洗涤、溶解、Ni-NTA凝胶柱亲和纯化后,获得了高纯度的NAOase。     

水稻类受体激酶OsCR4的抗体制备及特异性检测

运用生物信息学的方法对水稻类受体激酶OsCR4的抗原性进行分析,选取胞外部分片段与GST融合,在细菌大规模诱导该融合蛋白,利用GST sepharose进行亲和层析纯化,所得蛋白使用SDS-PAGE结合KCl/DTT染色切胶的方法得到收集。以此融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得了1：512,000效价的多克隆抗体,该抗体可特异识别水稻叶片微粒体组分中的OsCR4蛋白。     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株GP3蛋白的原核表达与纯化

利用限制性酶切从重组质粒pRSET-GP3中得到缺失N端疏水序列的基因片段tGP3(truncated GP3)。将tGP3克隆至原核高效表达载体pRSET,在E.coliBL21细胞中用IPTG诱导表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白(His)6-GP3,并用亲和层析法获得了纯化蛋白。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,从而为进一步研究PRRSV GP3结构蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。     

Expression of the rice hoja blanca virus (RHBV) non-structural protein 3 (NS3) in Escherichia coli and its in situ localization in RHBV-infected rice tissues

The non-structural NS3 protein gene from the rice hoja blanca virus (RHBV) was fused to the glutathione-S-transferase carboxilic end and expressed in Escherichia coli strain JM83. Large quantities of fusion protein were produced in insoluble form. The fusion protein was fractionated in SDS-PAGE and purified by electroelution, polyclonal antibodies were raised in rabbit and the antiserum was absorbed with bacterial crude extract. A band of similar size as that of NS3 protein was observed in Western blots using extracts from RHBV-infected rice plants. Immunoelectron microscopy with colloidal gold-labeled antibodies against NS3 protein and the viral nucleocapsid protein revealed in situ accumulation of NS3 protein in the cytoplasm but not in the viral inclusion bodies, vacuoles or chloroplasts of RHBV-infected plants, following the same pattern of distribution as the RHBV nucleocapsid protein.     

口蹄疫病毒免疫活性串联片段FB的表达及免疫原性测定(英)

将口蹄疫病毒(FMDV)免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD/TOPO中,经鉴定后得到重组质粒pBAD-FB,将此重组质粒转化到受体菌TOP10中,用诱导剂阿拉伯醛糖分别以不同的浓度进行诱导,并在不同诱导时间进行采样,经处理后做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹分析.结果发现以终浓度为0.002%的阿拉伯醛糖进行诱导,4 h后表达可达到高峰,其大小约为26 ku,软件扫描结果显示,FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28.9%,能与抗FMDV抗体发生特异性反应,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在.将融合蛋白的可溶性组分用50% Ni-NTA树脂过柱纯化并抽提融合蛋白的包涵体,经过洗涤后分别制成油乳剂疫苗,经皮下注射免疫豚鼠,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒.结果表明,用此融合蛋白的纯化产物和包涵体免疫豚鼠能诱导产生高滴度的中和抗体,对病毒的攻击提供100%的免疫保护.     

拟南芥Antiquitin基因的原核表达和生物信息学分析

将拟南芥Antiquitin基因重组到原核表达载体pMAL-c4x和pET41中,在T7 Express菌株中诱导表达,经Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白.SDS-PAGE结果表明:MBP和His-tag融合的拟南芥Antiquitin主要以可溶性形式存在,表达量分别占细胞总蛋白的25.1%和39.4%.以乙醛和NAD~+为底物测定融合蛋白活性,结果显示:His-tag融合的Antiquitin具有醛脱氢酶活性,比活力为8.98 U/mg,乙醛的表观K_m和V_(max)值分别为0.98 mmol/L和12.75 U/mg.序列比对和结构预测结果显示:拟南芥Antiquitin包含该家族蛋白典型的催化结构域、NADH结合结构域和寡聚化结构域,活性中心残基为Gly238、Gly291、Glu391、Phe393.     

拟南芥中一种AtBAG4蛋白的抗体制备和特异性检测

以拟南芥AtBAG4的全长cDNA,构建pET-51780重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以可溶形式存在;经Ni-NTA层析柱分离纯化,可得到分子质量约为49kDa的PAGE纯蛋白。用纯化的融合蛋白pET-51780免疫家兔,可得到抗AtBAG4抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别原核系统内表达的抗原以及拟南芥自身的抗原。